1.2培養(yǎng)基
人工海水(%，w/v):NaCl 2.5，MgSO40.5，KCl 0.1，CaCl20.02，K2HPO40.01，F(xiàn)eSO40.002;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(%，w/v):蛋白胨1，牛肉膏0.3，瓊脂粉1.5，NaCl 0.5，pH7.2～7.6;初篩培養(yǎng)基:2216 E固體培養(yǎng)基;復(fù)篩培養(yǎng)基(%，w/v):瓊脂粉0.2，酵母浸出粉0.3，人工海水配制，pH7.2～7.6;斜面培養(yǎng)基:同初篩培養(yǎng)基
1.3菌株的篩選
取樣地點(diǎn)是青島紅島近海海域。取近海沉積物于無菌密封袋中，常溫保存。取沉積物樣品5 g于45 mL無菌水中，振蕩搖勻。將稀釋10-1～10-5五個濃度梯度的樣液分別涂布在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1～2 d，挑取透明圈或凹陷較大的菌落點(diǎn)接于初篩平板培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記，在30℃下培養(yǎng)1～2 d后用盧戈氏碘液進(jìn)行染色，挑選透明圈與菌落的直徑比值大的菌落，并根據(jù)標(biāo)記挑取原菌落于初篩培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)1～2 d，挑取單菌落于復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)1～2 d，測發(fā)酵液的酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，并進(jìn)行斜面和甘油管保藏。
1.4瓊膠酶活力測定
于25 mL比色管中加入0.5 mL經(jīng)4℃6000 r/min離心10 min的發(fā)酵上清液和1.5 mL含0.5%瓊脂的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，置于50℃水浴保溫15～20 min后取出，加入1.0 mL DNS試劑終止酶解反應(yīng)，沸水浴顯色5 min，冷卻后定容至25 mL，充分搖勻后于5000 r/min離心10 min，取適量上清液在520 nm處測吸光值，將酶液煮沸滅活后同此法處理作為對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出上清液中的還原糖含量。酶活力單位定義為在上述條件下，1 min轉(zhuǎn)化生成1μg還原糖所需酶的量為一個酶活力單位(U/mL)。
1.5菌體生長和產(chǎn)酶曲線的測定
以3%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min，30℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每2 h取適量發(fā)酵液測生物量及酶活力，繪制生長曲線和產(chǎn)酶曲線。
1.6菌種形態(tài)學(xué)鑒定
觀察菌落在平板上的形態(tài)并對其進(jìn)行盧戈氏染色、革蘭氏染色并鏡檢觀察菌體形態(tài)等。
1.7系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
CTAB法提取菌株基因組DNA，將收集得到的DNA為模板，引物采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃2 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán);72℃10 min。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工生物工程有限公司測序。利用BLAST程序在GenBank上對結(jié)果進(jìn)行相似性比對，使用MEGA6.0的Neighbor-Joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
1.8酶學(xué)性質(zhì)研究
最適溫度的測定:在20～70℃下測定酶活力，其中底物濃度0.5%、反應(yīng)體系pH7.0;最適pH的測定:在pH4.0～9.0下測定酶活力，其中酶解溫度是45℃、底物濃度為0.5%;最適底物濃度的測定:在底物濃度0.1%～1.0%下測定酶活力，其中酶解溫度45℃、反應(yīng)體系pH7.0;金屬離子對酶解反應(yīng)的影響:將瓊膠酶酶液中分別加入Mn2+(MnCl2)、Ca2+(CaCl2)、Ba2+(BaCl2)、Na+(NaCl)、K+(KCl)、Mg2+(MgCl2)、Fe2+(FeCl2)使酶溶液含有5 mmol/L的金屬離子，4℃放置10 min后測定酶活力。以上實(shí)驗(yàn)做三次平行，結(jié)果取平均值。
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