研究探討了Toll/interleukin-1 receptor（TIR）結(jié)構(gòu)域含有的蛋白質(zhì)在免疫反應(yīng)中的重要性，尤其是在細(xì)菌對(duì)噬菌體的防御機(jī)制中。TIR結(jié)構(gòu)域廣泛存在于多種生物體中，包括哺乳動(dòng)物、植物和細(xì)菌，參與病原體識(shí)別和免疫信號(hào)傳導(dǎo)。然而在細(xì)菌系統(tǒng)中，TIR結(jié)構(gòu)域的具體功能尚未得到充分闡明。研究者們特別關(guān)注大腸桿菌（Escherichia coli），通過對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中所有可用的大腸桿菌基因組進(jìn)行全面調(diào)查，識(shí)別出781種含有TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步分析其在細(xì)菌免疫中的作用。研究發(fā)現(xiàn)37.5%的TIR結(jié)構(gòu)域含有的蛋白質(zhì)展現(xiàn)出抗噬菌體活性，這一發(fā)現(xiàn)揭示了細(xì)菌利用TIR系統(tǒng)進(jìn)行免疫防御的潛力。本研究認(rèn)為TIR結(jié)構(gòu)域的防御機(jī)制與哺乳動(dòng)物的Toll樣受體（TLRs）具有相似之處，后者通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）來啟動(dòng)免疫反應(yīng)。這種相似性不僅豐富了研究人員對(duì)細(xì)菌免疫機(jī)制的理解，也突顯了在進(jìn)化過程中，細(xì)菌如何發(fā)展出復(fù)雜的防御策略以應(yīng)對(duì)噬菌體的攻擊。盡管已識(shí)別出多種TIR結(jié)構(gòu)域含有的防御系統(tǒng)，但仍有許多蛋白質(zhì)的具體功能尚未明確。了解這些蛋白質(zhì)如何識(shí)別和響應(yīng)噬菌體的特定成分，對(duì)于揭示細(xì)菌的免疫機(jī)制至關(guān)重要。通過系統(tǒng)性地探索大腸桿菌中的TIR防御系統(tǒng)，研究人員希望填補(bǔ)這一知識(shí)空白，并為未來的研究提供基礎(chǔ)。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
將表達(dá)特定防御系統(tǒng)的大腸桿菌細(xì)胞過夜培養(yǎng)物接種到補(bǔ)充有50μg/mL卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，并在37°C下以200 rpm的振蕩速度孵育。含有空質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞用作對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD600 0.3時(shí)，將180μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至100孔板的每個(gè)微孔中，其中含有20μL 10倍連續(xù)稀釋的噬菌體。將板立即置于Bioscreen C自動(dòng)生長曲線分析系統(tǒng)上。培養(yǎng)物保持在37°C，持續(xù)振蕩，每5或10分鐘測(cè)量一次OD600，總持續(xù)時(shí)間為3小時(shí)。研究人員利用Bioscreen系統(tǒng)來測(cè)定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)對(duì)噬菌體感染的反應(yīng)。通過測(cè)量細(xì)菌的吸光度（OD600），可以了解噬菌體感染對(duì)細(xì)菌生長的影響，以及TIR系統(tǒng)是否有效抑制了噬菌體的增殖。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中，37.5%的TIR結(jié)構(gòu)域含有的蛋白質(zhì)展現(xiàn)出抗噬菌體活性。這表明TIR結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌免疫防御中發(fā)揮了重要作用。TIR系統(tǒng)能夠識(shí)別多種噬菌體成分，提供了一種復(fù)雜的機(jī)制用于病原體檢測(cè)和防御。這種識(shí)別能力與哺乳動(dòng)物的Toll樣受體（TLRs）相似，表明細(xì)菌和哺乳動(dòng)物在免疫機(jī)制上存在進(jìn)化上的平行。研究識(shí)別了12種新的TIR防御系統(tǒng)，這些系統(tǒng)在對(duì)不同噬菌體的防御中表現(xiàn)出不同的活性。這種多樣性可能是細(xì)菌在與噬菌體的進(jìn)化斗爭(zhēng)中形成的強(qiáng)大防御網(wǎng)絡(luò)的一部分。
圖1、篩選包含TIR結(jié)構(gòu)域的候選抗噬菌體防御系統(tǒng)。a）用于從NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的所有大腸桿菌基因組中識(shí)別包含TIR域的候選系統(tǒng)的流程圖。b）64個(gè)TIR候選防御系統(tǒng)的軌跡架構(gòu)。條形圖顯示了已測(cè)序的大腸桿菌基因組中每個(gè)簇的成員。以藍(lán)色突出顯示的集群表示本研究中克隆的32個(gè)TIR系統(tǒng)。結(jié)構(gòu)域：RT逆轉(zhuǎn)錄酶、功能未知的DUF結(jié)構(gòu)域、TPR四肽重復(fù)序列、TM跨膜。
圖2、大腸桿菌中12個(gè)具有TIR結(jié)構(gòu)域的抗噬菌體系統(tǒng)的鑒定。a）顯示了每個(gè)系統(tǒng)的域組織，并使用大腸桿菌MG1655針對(duì)111種不同噬菌體一式三份測(cè)定了它們的防御活性，如方法中所述。顏色表示EOP實(shí)驗(yàn)中每個(gè)TIR系統(tǒng)針對(duì)每個(gè)噬菌體的代表性結(jié)果的EOP減少倍數(shù)。條形圖顯示每個(gè)系統(tǒng)中限制的噬菌體數(shù)量。b）防御系統(tǒng)的基本域架構(gòu)和突變分析。
圖3、大腸桿菌TIR系統(tǒng)的廣泛識(shí)別譜。a)用于分離克服TIR防御系統(tǒng)的突變噬菌體的管道。含有單一TIR防御系統(tǒng)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞被噬菌體感染。含有空載體的大腸桿菌MG1655細(xì)胞用作對(duì)照。b)鑒定逃逸噬菌體中的突變基因?；疑珘K表明沒有分離出逃逸的噬菌體。每個(gè)栗色塊中的四角星和五角星表示突變基因的身份，如右側(cè)所示。c)對(duì)TIR系統(tǒng)敏感的基因的示意圖，涵蓋噬菌體復(fù)制的不同階段。d–g)TIR系統(tǒng)敏感基因在相應(yīng)TIR系統(tǒng)存在下的毒性。通過添加阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。缺乏TIR系統(tǒng)的空載體用作陰性對(duì)照。突變基因用于確定突變蛋白是否可以賦予噬菌體對(duì)TIR系統(tǒng)的抗性。
圖4、單個(gè)TIR防御系統(tǒng)可能對(duì)不同噬菌體的相同成分敏感。a–c噬菌斑測(cè)定表明，TIR-IV(a)、TIR-Retron(b)和Thoeris-II(c)系統(tǒng)分別對(duì)不同噬菌體的主要衣殼蛋白、DNA引物酶解旋酶和尾部蛋白敏感。缺乏TIR系統(tǒng)的空載體用作陰性對(duì)照。使用十倍系列稀釋的噬菌體進(jìn)行感染。蛋白質(zhì)中的突變位點(diǎn)用黑色箭頭表示。d噬菌體#41和#45主要衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)分析。使用AlphaFold2對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模并使用PyMOL進(jìn)行分析。突變位點(diǎn)以紅色突出顯示。e純化的WT和逃逸的噬菌體病毒粒子的電子顯微照片。測(cè)定一式三份進(jìn)行并顯示了代表性結(jié)果。f)表達(dá)滅活TIR-IV突變體的大腸桿菌MG1655上的WT（綠線）和逃逸噬菌體（藍(lán)線）#45、#41、#75和#106的感染動(dòng)力學(xué)。g)WT和逃逸噬菌體#45、#41、#75和#106在大腸桿菌MG1655上的一步生長曲線。
圖5、不同的TIR防御系統(tǒng)可能對(duì)不同噬菌體的相同成分敏感。a、b噬斑測(cè)定表明TIR-V(a)和TIR-IX(b)系統(tǒng)分別對(duì)噬菌體#20和#70的門蛋白敏感。缺乏TIR系統(tǒng)的空載體用作陰性對(duì)照。使用十倍系列稀釋的噬菌體進(jìn)行感染。蛋白質(zhì)中的突變位點(diǎn)用黑色箭頭表示。c）該圖顯示TIR-V和門蛋白表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致轉(zhuǎn)座酶S1/S4插入破壞TIR-V系統(tǒng)。直方圖顯示，在TIR-V系統(tǒng)存在下，門蛋白表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率顯著降低。數(shù)據(jù)以三個(gè)生物重復(fù)的平均值表示。d）噬菌斑測(cè)定表明，TIR-V的抗噬菌體活性被轉(zhuǎn)座酶S1/S4插入消除。e）在TIR-IX系統(tǒng)存在下，噬菌體#70的WT門蛋白的毒性。f,g）T7噬菌體門戶蛋白可以激活TIR-V，但不能激活TIR-IX系統(tǒng)(f)，而T4噬菌體門戶蛋白可以激活兩者(g)。h,i噬菌體T7（深黃色）、#20（紫色）、T4（淡紫色）和#70（青色）的門戶蛋白的結(jié)構(gòu)分析。j）TIR-V和TIR-IX蛋白的結(jié)構(gòu)和保守性分析。
總結(jié)
含有Toll/白細(xì)胞介素1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在多種生物體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但它們?cè)诩?xì)菌系統(tǒng)中的功能仍有待充分闡明。本研究以大腸桿菌為重點(diǎn)，探討了含有TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如何促進(jìn)細(xì)菌對(duì)噬菌體攻擊的免疫。通過對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的所有大腸桿菌基因組進(jìn)行詳盡的調(diào)查，并對(duì)90%已識(shí)別的含有TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中的32個(gè)代表進(jìn)行測(cè)試，研究發(fā)現(xiàn)很大一部分(37.5%)表現(xiàn)出抗噬菌體活性。這些防御系統(tǒng)可識(shí)別各種噬菌體成分，從而為病原體檢測(cè)和防御提供復(fù)雜的機(jī)制。在噬菌體逃逸突變體的選擇過程中，Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀用于快速篩選和鑒定那些能夠逃避TIR防御系統(tǒng)的噬菌體。通過連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)的生長情況，研究人員可以識(shí)別出在TIR防御系統(tǒng)存在下仍能生長的噬菌體，這些噬菌體可能是通過突變獲得了逃避TIR系統(tǒng)的能力。這項(xiàng)研究不僅強(qiáng)調(diào)了TIR系統(tǒng)在細(xì)菌免疫中的穩(wěn)健性，而且還與哺乳動(dòng)物Toll樣受體(TLR)的多樣性進(jìn)行了有趣的相似，豐富了人們對(duì)跨生命形式的先天免疫機(jī)制的理解，并強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌免疫的進(jìn)化意義。原核生物中的這些防御策略。本研究豐富了對(duì)細(xì)菌防御機(jī)制復(fù)雜性質(zhì)的理解，特別是大腸桿菌。本研究結(jié)果為理解TIR系統(tǒng)在細(xì)菌免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)，但它們也強(qiáng)調(diào)需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以充分闡明這些系統(tǒng)的復(fù)雜性。從這項(xiàng)研究中獲得的見解不僅增進(jìn)了我們?cè)谖⑸飳W(xué)方面的知識(shí)，而且為醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用鋪平了道路。
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