本研究從尿路感染患者尿液樣本中分離、鑒定大腸桿菌裂解性噬菌體，對(duì)其裂菌活性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析，為探索應(yīng)用噬菌體治療耐藥性尿路致病性大腸桿菌導(dǎo)致的尿路感染奠定基礎(chǔ)。利用雙層瓊脂平板法，從尿液樣品中分離、純化，得到一株能裂解大腸桿菌的噬菌體。通過電鏡觀察噬菌體形態(tài)，測(cè)定其裂菌譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線、以及熱穩(wěn)定性、紫外敏感性和氯仿敏感性等生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，成功分離、純化得到一株能高效裂解大腸桿菌的噬菌體vB_EcoS_JA2，該噬菌體可形成圓形、透明、邊緣整齊的噬菌斑；電鏡觀察噬菌體的頭部呈六邊形，含可收縮性尾部，尾部較長；一步生長曲線顯示，該噬菌體的潛伏期為10 min、爆發(fā)期為60 min、裂解量高達(dá)124 PFU/Cell，其最佳感染復(fù)數(shù)為0.1；JA2具有較好的熱穩(wěn)定性，且對(duì)紫外線具有一定的抵抗力。分離鑒定的噬菌體JA2能裂解致病性大腸桿菌，具有穩(wěn)定性好，抵抗力強(qiáng)的特點(diǎn)，為應(yīng)用噬菌體治療致病性大腸桿菌導(dǎo)致的尿路感染提供了新材料。
大腸桿菌是醫(yī)院獲得性感染最常見的致病菌，在臨床分離鑒定中出現(xiàn)頻率僅次于銅綠假單胞菌。該病原主要引起呼吸道感染、泌尿道感染、傷口感染、膽道感染、腹膜炎、敗血癥和腦膜炎等。尿路致病性大腸桿菌（Uropathogenic，UPEC）是人腎盂腎炎和其他泌尿系感染常見的病原菌，可頑固地存在于膀胱組織中從而引起復(fù)發(fā)性尿路感染，嚴(yán)重可引起溶血性尿毒綜合征，可對(duì)患者腎臟造成不可恢復(fù)性損傷和患者死亡。近年來的細(xì)菌流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，大腸桿菌耐藥性逐年上升，已成為臨床治療面臨的巨大挑戰(zhàn)。
噬菌體（Bacteriophage，Phage）是感染細(xì)菌的病毒，噬菌體能夠靶向裂解宿主菌，也影響宿主菌生物學(xué)性狀和進(jìn)化。當(dāng)前，細(xì)菌耐藥問題日益突出，臨床研究發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)多種細(xì)菌感染均顯示出良好的治療效果。同時(shí)，由于噬菌體具有特異性強(qiáng)、增殖迅速、來源廣泛等特點(diǎn)，有望作為一種新的抗菌制劑，成為耐藥性細(xì)菌抗生素治療的補(bǔ)充或有效替代。相關(guān)研究結(jié)果表明，噬菌體治療可以減少動(dòng)物體內(nèi)含菌量，降低病死率，甚至可以徹底治愈病原性細(xì)菌感染。但由于噬菌體存在較強(qiáng)的宿主特異性，其裂解效果僅局限于單一或部分菌株，而臨床的細(xì)菌感染，尤其是尿路感染，其發(fā)病通常是由于多種細(xì)菌混合感染所致，單一噬菌體的治療尚不足以達(dá)到理想效果。此外，目前噬菌體治療策略仍存在細(xì)菌抗噬菌體突變、治療時(shí)間和劑量、噬菌體制劑安全性及使用條件的問題，同時(shí)，隨著細(xì)菌耐藥性問題的加重，使不易導(dǎo)致耐藥的噬菌體療法更受重視，研發(fā)篩選出具備高效裂解能力、環(huán)境適應(yīng)性和穩(wěn)定性良好、基因組上不攜帶毒力因子且易于分離和純化的噬菌體劑型的需求極為迫切。為進(jìn)一步開展噬菌體治療大腸桿菌感染的研究，本研究對(duì)從尿路感染病例患者尿液中分離的大腸桿菌噬菌體的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，以期為探索應(yīng)用噬菌體治療尿路致病性大腸桿菌感染打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料及菌株
本實(shí)驗(yàn)中噬菌體及尿路感染來源細(xì)菌均分離自井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院尿路感染患者尿液標(biāo)本。大腸桿菌K-12菌株MC1061、MG1655、DM1187及大腸桿菌O157:H7菌株Min27均由上海交通大學(xué)嚴(yán)亞賢教授惠贈(zèng)。大腸桿菌U4372、U4261等菌株（表1）均分離自臨床尿路感染病例尿液樣品，金黃色葡萄球菌ATCC43300由井岡山大學(xué)鄧先清副教授惠贈(zèng)。
1.2主要培養(yǎng)基及試劑
液體LB培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10.0 g，酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，加超純水定容至1L，1×105Pa、121℃滅菌20 min。半固體LB培養(yǎng)基（上層瓊脂）：在液體LB中加入7g/L瓊脂粉。固體LB培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉。磷酸鹽緩沖液（PBS）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.42 g，KH2PO40.27 g，在燒杯中加入800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，加去離子水將溶液定容至1L，高溫高壓滅菌后室溫保存。
1.3噬菌體分離與鑒定
將尿液樣品通過0.22μm濾膜過濾，所得濾液再依次加入PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋，利用雙層瓊脂平板法，以大腸桿菌K-12菌株MC1061作為指示菌，進(jìn)行噬菌斑形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)尿液樣品中是否含有裂解性噬菌體。
1.4噬菌體的純化
在試管加入中5 mL液體LB培養(yǎng)基和200μL大腸桿菌K-12菌株MC 1061，置于搖床37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 h。挑取單個(gè)噬菌斑，加入試管中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，利用雙層瓊脂平板法，進(jìn)行空斑純化，直至得到大小一致、形態(tài)相同的噬菌斑。
1.5噬菌體電鏡觀察
采用2%磷鎢酸負(fù)染法，通過電鏡（TEM，Thermo Fisher Talos L120C）觀察噬菌體形態(tài)。
1.6噬菌體核酸類型鑒定
提取噬菌體基因組，分別用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease處理噬菌體基因組，37℃消化2 h，將消化產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定。
1.7噬菌體的生物學(xué)特性分析
對(duì)噬菌體裂菌譜，最佳感染復(fù)數(shù)，一步生長曲線，pH穩(wěn)定性，對(duì)紫外線、氯仿的敏感性，熱穩(wěn)定性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析。
1.7.1噬菌體裂菌譜的測(cè)定
將500μL待測(cè)菌液加入10 mL融化的半固體LB培養(yǎng)基中，混勻后倒入固體LB培養(yǎng)基平板上，待凝固后，在雙層瓊脂上打孔，加入200μL噬菌體上清液，在37℃條件下過夜培養(yǎng)，觀察并測(cè)量裂菌圈的大小。
1.7.2噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）
分別測(cè)定菌液濃度及噬菌體效價(jià)，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例將噬菌體與指示菌MC1061混合，培養(yǎng)8 h后過濾，利用雙層瓊脂平板法分別測(cè)定各個(gè)比例條件下噬菌體的效價(jià)，其中噬菌體效價(jià)最高的MOI即為最佳感染復(fù)數(shù)。
1.7.3噬菌體一步生長曲線測(cè)定
按照最佳感染復(fù)數(shù)MOI比例，將噬菌體與對(duì)數(shù)生長期的指示菌MC1061菌液混合，置于搖床37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120、150 min時(shí)間點(diǎn)取樣，經(jīng)濾膜過濾后，通過雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)進(jìn)而繪制出噬菌體的一步生長曲線。
1.7.4噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定
分別取900μL的液體LB培養(yǎng)基至1.5 mL EP管中，將EP管置于37、40、50、60、70、80℃水浴鍋中預(yù)熱，待液體LB培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定后，加入100μL噬菌體上清液，在作用30 min后取出EP管。采用雙層瓊脂平板法獲得各溫度條件下的噬菌體效價(jià)，從而評(píng)價(jià)噬菌體的熱穩(wěn)定性。
1.7.5噬菌體對(duì)氯仿的敏感性測(cè)定
將噬菌體上清液與氯仿按照0、1%、2%、5%的比例進(jìn)行混合，置于37℃水浴鍋中孵育30 min，分別在分層液中各取上層液體100μL，采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行噬菌體效價(jià)測(cè)定，評(píng)價(jià)噬菌體對(duì)氯仿的敏感性。
1.7.6噬菌體對(duì)紫外線的敏感性測(cè)定
取5 mL噬菌體液加入滅菌一次性平皿中，在紫外燈照射下，于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min時(shí)間點(diǎn)取樣，通過雙層瓊脂平板法，測(cè)定噬菌體的效價(jià)，進(jìn)而評(píng)估噬菌體的紫外敏感性。
1.7.7 pH穩(wěn)定性測(cè)定
利用NaOH和HCl分別將LB培養(yǎng)基通過pH計(jì)對(duì)應(yīng)pH（pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14），高壓滅菌備用。分別取900μL不同pH值的LB液體培養(yǎng)基至1.5 mL EP管中，各加入100μL噬菌體，并在37℃水浴中孵育1 h，雙層瓊脂平板法測(cè)定處理后的噬菌體效價(jià)，評(píng)價(jià)噬菌體pH穩(wěn)定性。
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