摘要哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的病原菌，通過(guò)對(duì)峙試驗(yàn)研究哈芡木霉菌對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在室內(nèi)能夠很好地抑制灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。哈茨木霉菌的培養(yǎng)采用固液雙相培養(yǎng)的方法，用正交試驗(yàn)優(yōu)化法分別對(duì)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在優(yōu)化好的固液雙相培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個(gè)孢子。
番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能夠侵染番茄葉片、莖和青果等植株地上部分，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成大量爛花、爛果，直接影響產(chǎn)量。木霉菌作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中，具有適應(yīng)性強(qiáng)、存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點(diǎn)。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中應(yīng)用最早、最廣的一個(gè)菌種，可以用于預(yù)防由腐霉菌、立枯絲核菌、鐮刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害。
哈茨木霉孢子耐受性強(qiáng)，易于加工成制劑，是一類重要的生防真菌，其真菌孢子培養(yǎng)主要采用固體發(fā)酵。固體發(fā)酵雖然操作簡(jiǎn)單，但易受雜菌污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效率低。目前，主要采用先用液體發(fā)酵產(chǎn)生菌絲，再將菌液接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生孢子的固液雙相發(fā)酵培養(yǎng)模式。正交試驗(yàn)優(yōu)化法是優(yōu)化培養(yǎng)基常用的方法。因此，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化法對(duì)哈茨木霉的培養(yǎng)進(jìn)行初步優(yōu)化，為其在生防中的應(yīng)用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料與儀器
供試菌種為哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物農(nóng)藥工程研究中心分離獲得；試驗(yàn)儀器有恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、冰箱；試劑有葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板對(duì)峙培養(yǎng)是研究生防菌效價(jià)最常用的方法之一，該方法操作簡(jiǎn)單，能直接觀察抑制效果，因而本試驗(yàn)采用平板對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)定哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制效果。具體操作如下：在PDA培養(yǎng)基中心位置接種直徑為6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌餅，距離平板中心兩側(cè)2 cm處，分別接種一塊直徑為6 mm的哈茨木霉菌菌餅，以只接種番茄灰葡萄孢菌菌餅為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)6～9 d后，與對(duì)照對(duì)比，觀察記載哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制情況，每組處理3次重復(fù)。
1.2.2哈茨木霉菌培養(yǎng)基優(yōu)化。
（1）液體培養(yǎng)基優(yōu)化。取制好的哈茨木霉菌孢子種子液（濃度為108 cfu/mL），按1%接種量分別接種于不同處理的液體培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。培養(yǎng)條件為25℃，搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，7 d后過(guò)濾菌絲，80℃烘干并稱量菌絲干重。每個(gè)處理3次重復(fù)。
（2）固體培養(yǎng)基優(yōu)化。取培養(yǎng)7 d的哈茨木霉菌菌絲懸浮液種子液（菌絲干重約為0.002 g/mL）按20%接種量分別接種于不同處理的固體蛭石培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。培養(yǎng)條件為25℃，培養(yǎng)5 d，5 d后采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子數(shù)目。
2結(jié)果與分析
2.1哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用
由圖1可知，茨木霉菌在室內(nèi)對(duì)番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)迅速，第3天哈茨木霉菌就表現(xiàn)出對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。對(duì)峙試驗(yàn)第5天時(shí)，可以明顯看出哈茨木霉菌繼續(xù)生長(zhǎng)，占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿，番茄灰葡萄孢菌菌絲出現(xiàn)濃縮、消解等現(xiàn)象。在顯微鏡觀察下，哈茨木霉菌菌絲入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌絲出現(xiàn)斷裂。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，最終番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。
2.2哈茨木霉菌的培養(yǎng)基優(yōu)化
2.2.1液體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌孢子接種到表1中配方水平的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，稱量菌絲干重，結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，該哈茨木霉菌液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生餅粉4%。endprint
2.2.2固體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌菌絲接種到表2的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。可以看出，該哈茨木霉菌液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生餅粉4%、麥麩6%。
3結(jié)論與討論
哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，能夠抑制多種植物病原菌生長(zhǎng)。平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，哈茨木霉菌能夠很好地抑制番茄灰霉病菌生長(zhǎng)。以往研究多側(cè)重于哈茨木霉菌菌絲的生長(zhǎng)，但菌絲不易于保存及應(yīng)用，加工成制劑困難。國(guó)外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多數(shù)是孢子制劑。本試驗(yàn)哈茨木霉菌在優(yōu)化的固液雙向培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個(gè)孢子，方便加工成制劑及運(yùn)輸。
本試驗(yàn)僅限于室內(nèi)平板培養(yǎng)，對(duì)于該哈茨木霉菌在大田生產(chǎn)上是否具有良好的防效有待于進(jìn)一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性強(qiáng)、耐儲(chǔ)存、方便運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，液體發(fā)酵生產(chǎn)出較多菌絲，固體發(fā)酵易受雜菌的污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，因而采用固液雙相發(fā)酵的方法是一種不錯(cuò)的選擇。正交優(yōu)化初步對(duì)哈茨木霉菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，哈茨木霉菌產(chǎn)生孢子受光照、溫度等很多條件的影響，下一步需要通過(guò)正交優(yōu)化或者響應(yīng)面法進(jìn)一步深度優(yōu)化。
相關(guān)新聞推薦
1、牛月形單胞菌分離培養(yǎng)方法及生長(zhǎng)曲線繪制
2、江米酒曲中高產(chǎn)凝乳酶菌篩選、生長(zhǎng)曲線及凝乳活力及蛋白水解活力測(cè)定（三）
3、家蠅抗菌肽AMP-17抑制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，為解決銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題提供新思路