2結果與分析
2.1菌體生長及產(chǎn)酶曲線
對菌體進行搖瓶發(fā)酵，每2 h取少量發(fā)酵液測其酶活力和在600 nm處的吸光值，由圖1知，發(fā)酵前期菌體生長速度較快，在20 h后生物量基本達到平衡，酶活力在24～26 h處達到最大。
圖1菌株生長及產(chǎn)酶曲線
圖2盧戈氏染色結果
2.2篩選及形態(tài)學鑒定
將該菌在平板上培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基表面形成明顯白色菌落，菌落表面濕滑，邊緣平整，中央凹陷。對菌落進行盧戈氏碘液染色，染色結果如圖2所示，菌落周圍形成明顯的透明水解圈，這是由于培養(yǎng)基被降解的部分生成具有還原性的寡糖，不能被盧戈氏碘液染色，而未被降解掉的部分能夠被盧戈氏碘液染成深色。對菌落進行革蘭氏染色鏡檢結果如圖3所示，菌體被染成紅色，表明該菌屬革蘭氏陰性菌，與已報道的絕大多數(shù)產(chǎn)瓊膠酶菌株屬革蘭氏陰性菌結果相符。
圖3革蘭氏染色鏡檢結果
圖4依據(jù)16S rDNA序列同源性比較構建的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構建
用MEGA6.0軟件，根據(jù)16S rDNA序列相似性，將該菌與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應的細菌一起構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，該序列與Acinetobacterbeijerinckii(Genbank Accession No.KX856281.1)和Acinetobacterbouvetii(Genbank Accession No.NR117628.1)等菌屬相似性高達99%，能夠證明菌LXK為不動桿菌(Acinetobactersp.)。目前，不動桿菌產(chǎn)瓊膠酶的研究報道較少，僅Lakshmikanth等人和陳虹等人從土壤中篩選出能夠產(chǎn)瓊膠酶的不動桿菌，從海洋環(huán)境中分離出產(chǎn)瓊膠酶的不動桿菌未見報道。
2.4酶解反應最適溫度的確定
將酶反應體系分別置于20、30、40、50、60和70℃的水浴中反應，測定各溫度下瓊膠酶活力，結果見圖5。從圖5中可以看出，最適酶解溫度為40℃，溫度過高和過低都不利于酶解，這與來自不動桿菌AG LSL-1、紫色桿菌SY12、弧菌JMUAZ6的瓊膠酶的最適酶解溫度相同。由于瓊膠具有凝固性，當溫度較低時底物發(fā)生凝固，粗酶液與底物的接觸面積減少，酶解效率降低;溫度過高時，酶受熱失活，同樣影響酶解效率。
圖5溫度對瓊膠酶活性的影響
2.5酶解反應最適底物濃度的確定
選取0.1%～1.0%的濃度梯度研究瓊脂粉濃度對瓊膠酶活力的影響，實驗結果見圖6。從圖6中可以看出，隨著底物濃度的增大，瓊膠酶活力隨之增大，在底物濃度為0.5%時瓊膠酶活力達到最大值，繼續(xù)增大底物濃度，瓊膠酶活力逐漸下降，原因是底物濃度過大，降低了分子的擴散性，降低酶解反應效率。因此，酶的最適底物濃度為0.5%。
圖6底物濃度對瓊膠酶活力的影響
2.6酶解反應體系最適pH的確定
圖7酶解反應體系pH對瓊膠酶活力的影響
反應體系pH可以影響酶的結構和穩(wěn)定性，同時底物和酶的解離狀態(tài)也受pH的影響。為探究反應體系pH對瓊膠酶活力的影響，選取pH4.0～9.0六個pH梯度進行酶解實驗，結果見圖7。由圖7可知，瓊膠酶活力隨著體系pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，在pH8.0附近達到最大值，繼續(xù)增大pH，瓊膠酶活力反而下降，可能是強堿性環(huán)境導致酶蛋白變性從而使瓊膠酶失活。
2.7金屬離子對酶解反應的影響
選取7種金屬離子研究它們對酶解反應的影響，結果見圖8。從圖中可以看出，K+和Ca2+能促進酶解反應，Na+和Mg2+對酶解反應的影響較小，而Fe2+、Mn+和Ba2+對酶解反應起抑制作用，此結果與瓊膠酶降解菌Agarivoranssp.LQ48、Vibriosp.JMUAZ5研究結果相似。
圖8金屬離子對酶解反應的影響
3結論
本研究通過大量篩選工作，從海洋環(huán)境分離得到一株具有瓊膠酶活性的細菌，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌，并通過16Sr RNA基因序列的測定，確定該菌為不動桿菌，是首次從海洋環(huán)境中分離出的能夠產(chǎn)瓊膠酶的不動桿菌，并命名為不動桿菌Acinetobactersp.LXK。對該菌的粗酶學特性進行了初步研究，結果表明，最適酶解溫度為40℃，酶解最適底物濃度在0.5%，酶解反應體系最適pH在8.0，K+和Ca2+能促進酶解反應，Na+和Mg2+對酶解反應的影響較小，而Fe2+、Mn+和Ba2+對酶解反應起抑制作用。本研究的開展為海洋多糖的深入研究和瓊膠寡糖的規(guī)?；a(chǎn)起到了極大的促進作用。
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