2結果與分析
2.1酒曲中產凝乳酶優(yōu)勢菌株的確定
2.1.1菌株初篩
利用倍比稀釋法從發(fā)酵的江米酒中分離純化得到13株不同菌落形態(tài)的純種菌株，將分離純化得到的13株不同菌株分別以三點法點接于酪蛋白平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 d，觀察并測定菌株所產凝乳圈及水解圈直徑（表1）。
表1不同菌株在酪蛋白平板上凝乳圈和水解圈直徑
從表1可以看出，LB-41D、PDA-41、PDA-61、PDA-82和yD-42這5株菌所產凝乳圈和水解圈直徑為0，表明這5株菌不產生凝乳酶。其余8株菌在酪蛋白平板上都有不同大小的凝乳圈和水解圈。白色凝乳圈大說明菌株產凝乳酶的凝乳活力高，水解圈大說明菌株產凝乳酶蛋白水解活力高。菌株所產凝乳酶蛋白水解活力的大小對干酪質構和特殊風味有著重要的影響，蛋白水解活力高使干酪中蛋白水解過度生成苦味肽而導致制作的干酪有苦味，使消費者難以接受。所以在篩選過程中應選取凝乳活力高而蛋白水解活力低的菌株。從有不同大小凝乳圈和水解圈的8株不同菌株來看，其中LB-51菌株所產凝乳圈直徑最大同時水解圈直徑較小，由此可以初步選擇LB-51菌株為產凝乳酶優(yōu)勢菌。
2.1.2菌株的復篩
將有白色凝乳圈的8株菌分別接種于LB、yPD和PDA液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，測定凝乳和蛋白水解活力，結果如表2所示。
表2菌株在不同培養(yǎng)基中產酶活力
由表2可知，菌株在LB中產凝乳酶的凝乳活力相對較高，在液體PDA培養(yǎng)基中產凝乳酶的凝乳活力最低。其中LB-51菌株在LB中發(fā)酵24 h時產凝乳酶的凝乳活力可達320 SU/mL，在8株菌中產凝乳酶的凝乳活力最高，同時LB-51菌株在LB中發(fā)酵時蛋白水解活力相對較低。所以確定LB-51菌株是酒曲中產凝乳酶的優(yōu)勢菌。對于8株菌株選擇了3種不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，只有在LB中產凝乳酶的凝乳活力較為理想；部分菌株在yPD和PDA中產酶活力不高或不產凝乳酶，這與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分和比例有關，說明這2種培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和比例不適合菌株產凝乳酶。所以3種液體培養(yǎng)基中選擇LB作為基礎培養(yǎng)基，可通過優(yōu)化其營養(yǎng)成分和比例來進一步提高菌株的產凝乳酶的凝乳活力。
2.2菌株初步鑒定
2.2.1形態(tài)學觀察
圖1 LB-51菌株菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色照片（B）
將菌株LB-51在LB固體平板上劃線培養(yǎng)48 h后，其菌落為乳白色稍顯微黃，菌落邊緣不整齊，表面粗糙有黏液，不透明。通過革蘭氏染色、芽孢染色和穿刺培養(yǎng)實驗，菌株LB-51為革蘭氏反應為陽性，短桿狀，具有運動性，有芽孢，芽孢中生。
2.2.2 API生化試劑條法
將API生化試劑條法對菌株LB-51的發(fā)酵結果（表3）提交ApiWeb軟件中進行比對鑒定，結果可初步判定菌株LB-51為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）或地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）。
表3 LB-51菌株的主要生理學特性
2.2.3菌株16S rDNA序列擴增結果
圖2菌株LB-51的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖
以菌株LB-51基因組DNA為模板，經PCR擴增后產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果在約1 500 bp處有一條特異性條帶，結果見圖2。將PCR產物回收純化后進行測序，結果菌株LB-51的16S rDNA序列長度為1 450 bp。
2.2.4基于16S rDNA序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析
圖3以16S rDNA序列為基礎的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
將菌株LB-51的16S rDNA基因序列與在GenBank中序列大小相近的已知菌株的相應序列進行比對，然后選取與LB-51序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA6.0軟件進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果如圖3所示，菌株LB-51與解淀粉芽孢桿菌MPA1034（HQ231913.1）在同一分支上，并通過MEGA 6.0軟件中Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，且支持率可達100%。結合上述形態(tài)學、生理生化實驗結果可將菌株LB-51確定為解淀粉芽孢桿菌，并進一步將此產凝乳酶菌株命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。
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