2結(jié)果與分析
2.1照光對稻曲病菌菌絲生長的影響
對在PSA平板上培養(yǎng)7、15、20 d后的ZJ09菌株菌落直徑進(jìn)行測量，結(jié)果表明：黑暗組和照光組的菌落直徑差異顯著（P＜0.01），培養(yǎng)7、15、20 d后照光組的菌落直徑都顯著小于黑暗組的菌落直徑（圖1）。用顯微鏡觀察2組菌落，比較其菌落內(nèi)部（非邊緣區(qū)域）可以看到，2組菌落的厚度、菌絲密度無明顯差異；從菌落邊緣可以看到，2組菌落的菌絲在粗細(xì)、分支情況方面都未見明顯差異（圖2）。由此可得，照光組和黑暗組稻曲病菌的菌落直徑有顯著差異，反映出二者菌絲生長速率不同，表明照光可以明顯抑制稻曲病菌菌絲的生長。
圖1照光對PSA平板上ZJ09菌株菌落生長的影響
圖2黑暗組與照光組ZJ09菌株菌落狀態(tài)的比較
2.2文庫及轉(zhuǎn)錄組輸出數(shù)據(jù)結(jié)果
為了從轉(zhuǎn)錄組水平探究照光抑制ZJ09菌株菌絲生長的機(jī)制，本試驗構(gòu)建了4個cDNA文庫（CK_D1、CK_D2、Uv_L1和Uv_L2），其中，文庫CK_D1與CK_D2為黑暗組的2個重復(fù)，文庫Uv_L1與Uv_L2為照光組的2個重復(fù)。文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行高通量測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)整理、過濾后，共獲得6G數(shù)據(jù)量的高質(zhì)量序列，達(dá)到轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?shù)據(jù)深度的要求。最終的序列數(shù)量、堿基數(shù)量以及識別準(zhǔn)確率見表2。從中可以看出，高質(zhì)量識別序列占比及高質(zhì)量識別序列堿基占比均大于97%。
轉(zhuǎn)錄組測序所得序列與稻曲病菌參考基因組的比對結(jié)果見表3。從中可以看出：在4個文庫測序所得序列中，能與參考基因組序列匹配的序列占比均超過85%，且僅比對到一個位置上的序列占比均超過97%。
上述結(jié)果表明，本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果質(zhì)量優(yōu)良，可用于生物信息學(xué)統(tǒng)計和分析。
2.3差異表達(dá)基因的鑒定結(jié)果
對黑暗組與照光組ZJ09菌株菌絲的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，共得到695個DEGs，其中359個被照光上調(diào)表達(dá)，336個被照光下調(diào)表達(dá)。
2.4差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果
GO的基本單位是類別（term），可分為生物過程（biological process）、細(xì)胞成分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個大類別，每個大類別中包含許多亞功能類別。如圖3所示，在本試驗得到的695個DEGs中，491個DEGs獲得GO富集，3個GO大類別中都有DEGs富集。在生物過程大類別中，富集較多DEGs的GO亞功能類別為代謝過程、含氮化合物代謝過程、生物合成過程、有機(jī)氮化合物代謝過程、細(xì)胞生物合成過程、有機(jī)物生物合成過程、蛋白質(zhì)代謝過程、細(xì)胞蛋白代謝過程。在細(xì)胞成分大類別中，富集較多DEGs的GO亞功能類別為無膜細(xì)胞器、胞內(nèi)無膜細(xì)胞器、胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、核糖核蛋白復(fù)合物、核糖體。在分子功能大類別中，富集較多DEGs的GO亞功能類別為氧化還原酶活性、核糖體結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性。初步可以看出，照光主要在這些GO類別所描述的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能方面對稻曲病菌菌絲產(chǎn)生了影響，從而抑制了稻曲病菌的生長速率。
圖3稻曲病菌菌絲差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果
2.5差異表達(dá)基因的KEGG通路注釋結(jié)果
本試驗所得的DEGs被注釋到152個KEGG通路中，富集DEGs最顯著的20條通路見表4。在這20條通路中，核糖體通路涉及的DEGs有59個，明顯多于其他的KEGG通路。但在除核糖體通路外的其余19條通路中，發(fā)現(xiàn)有8條通路與氨基酸代謝有關(guān)，涉及53個DEGs。上述結(jié)果說明，照光抑制稻曲病菌菌絲的生長可能與核糖體結(jié)構(gòu)和功能，以及氨基酸代謝受到影響有較大關(guān)系。
2.6照光對乙酰輔酶A合成酶編碼基因表達(dá)水平的影響
對鑒定到的695個DEGs，除利用軟件進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析外，還逐一考察了每個DEG的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DEGs中包含1個乙酰輔酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase,ACS）編碼基因，照光組樣品中ACS編碼基因的表達(dá)水平只有黑暗組樣品的18.2%，說明照光對稻曲病菌菌絲中ACS編碼基因的表達(dá)存在顯著的抑制效果。ACS可催化乙酰輔酶A的合成，是微生物體內(nèi)乙酰輔酶A的重要來源之一。乙酰輔酶A是生物體內(nèi)物質(zhì)和能量代謝的樞紐性物質(zhì)。抑制ACS編碼基因的表達(dá)有可能減少生物體內(nèi)乙酰輔酶A的含量，從而影響乙酰輔酶A參與的眾多代謝過程。因此，推測照光抑制稻曲病菌菌絲的生長可能與其抑制ACS編碼基因的表達(dá)有很大關(guān)系。
表3過濾后的測序數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對結(jié)果
2.7 RT-qPCR對轉(zhuǎn)錄組測序驗證的結(jié)果
如圖4所示，受測的6個基因（分別對應(yīng)表1中編號2～7所代表的基因）中，有3個受照光上調(diào)表達(dá)，另外3個受照光下調(diào)表達(dá)；這6個基因表達(dá)的變化趨勢與用轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)論一致，說明本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可信度很高。
圖4轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的RT-qPCR驗證
3、討論
關(guān)于照光對稻曲病菌菌絲生長的影響，有研究報道了2種不同的結(jié)論。FU等和季宏平分別報道了照光對稻曲病菌菌絲生長的抑制作用；呂銳玲等和陸凡等的研究則得出，照光對稻曲病菌菌絲生長無影響。本研究發(fā)現(xiàn)，照光組稻曲病菌菌絲的生長速率明顯低于黑暗組的生長速率，顯示照光可以抑制菌絲的生長，表明照光條件是該菌菌絲生長的調(diào)控因子之一。
為了進(jìn)一步探究照光抑制稻曲病菌菌絲生長的機(jī)制，本研究還分別采集照光和黑暗條件下培養(yǎng)的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過比較2組菌絲的轉(zhuǎn)錄組鑒定了DEGs，并對DEGs進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析。這是關(guān)于照光影響稻曲病菌菌絲生長分子機(jī)制的首次報道。
乙酰輔酶A是各類生物體中極其重要的能量及物質(zhì)代謝中間產(chǎn)物，參與生物體內(nèi)許多重要的代謝過程，比如三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成，等等。在微生物體內(nèi)，ACS可催化乙酸直接轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。野生型的希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）能在以乙酸、乙醇或乙醛作為碳源的培養(yǎng)基上存活，但ACS編碼基因ChAcs1被敲除的希金斯炭疽菌不能在這些培養(yǎng)基上存活。當(dāng)微生物在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長時，理論上葡萄糖可經(jīng)過糖酵解分解為丙酮酸，而丙酮酸可以借由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（包含丙酮酸脫羧酶、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、二氫硫辛酸脫氫酶）催化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A，因此可以不依賴ACS。然而，即使有葡萄糖作為碳源，敲除ChAcs1仍可顯著改變希金斯炭疽菌中一系列碳代謝相關(guān)基因的表達(dá)，并使菌絲中的脂含量降至野生型菌株的60%。VAN DEN BERG等嘗試將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的2個ACS編碼基因之一ACS2失活，發(fā)現(xiàn)酵母菌突變菌株在含葡萄糖的培養(yǎng)基上的生長受到抑制；進(jìn)一步將2個ACS編碼基因ACS1和ACS2同時失活，發(fā)現(xiàn)酵母菌突變菌株在含葡萄糖的培養(yǎng)基上也不能存活，說明即使有葡萄糖作為營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌的存活也離不開ACS。上述研究表明，不管微生物利用何種碳源，ACS都具有重要作用。本研究的結(jié)果顯示：照光可顯著抑制稻曲病菌菌絲中ACS編碼基因的表達(dá)，削弱菌絲的乙酰輔酶A合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌絲生長的機(jī)制之一。
HOG1（high osmolarity glycerol 1）是最先從釀酒酵母中鑒定出的一種蛋白激酶，現(xiàn)已被證實廣泛存在于各種真核生物中。HOG1介導(dǎo)的信號途徑參與調(diào)控真核細(xì)胞對滲透脅迫的響應(yīng)。ZHENG等敲除稻曲病菌的HOG1編碼基因UvHOG1后，發(fā)現(xiàn)突變體菌絲的生長明顯弱于野生型菌絲，顯示稻曲病菌的HOG1可調(diào)控菌絲的生長。本試驗從黑暗組與照光組稻曲病菌菌絲中均檢測到UvHOG1基因的表達(dá)，但2組菌絲中該基因的表達(dá)量無明顯差異，因此該基因不屬于DEG，說明照光對菌絲中UvHOG1基因的表達(dá)沒有影響。因此，推測照光抑制稻曲病菌菌絲的生長與蛋白激酶HOG1無關(guān)。
表4稻曲病菌菌絲差異表達(dá)基因的KEGG通路分析結(jié)果
Bax抑制子1（Bax inhibitor-1,BI-1）是一種在動物、植物和真菌中都存在的高度保守的細(xì)胞死亡調(diào)控因子。此蛋白能抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax誘發(fā)的細(xì)胞死亡，具有抗細(xì)胞凋亡功能。XIE等敲除稻曲病菌的BI-1同源基因UvBI-1后，菌絲的生長速率有所提高。與UvHOG1基因類似，在本稻曲病菌菌絲轉(zhuǎn)錄組研究的結(jié)果中，UvBI-1基因不屬于DEG，說明照光對菌絲中UvBI-1基因的表達(dá)沒有影響，因此推測照光抑制稻曲病菌菌絲的生長與BI-1無關(guān)。
本轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果顯示，一些其他植物病原真菌致病力相關(guān)因子的編碼基因在稻曲病菌中的同源基因被照光上調(diào)表達(dá)，比如DEGs包含1個CFEM（conserved fungal-specific extra-cellular membranespanning）蛋白的編碼基因（UVI_02042610），其在照光組菌絲中的表達(dá)水平是在黑暗組菌絲中的23.9倍，表明照光可能顯著上調(diào)菌絲中CFEM蛋白的表達(dá)。CFEM蛋白為真菌所特有，已被證實是植物病原真菌效應(yīng)子。比如禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）與稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的CFEM蛋白已被證實在病原菌侵染寄主植物的過程中發(fā)揮作用。除CFEM蛋白編碼基因外，本研究中鑒定到的DEGs還包括過氧化物酶體銅胺氧化酶編碼基因、過氧化物酶體膜蛋白編碼基因，二者的表達(dá)均被照光上調(diào)。已有研究表明，植物病原真菌過氧化物酶體與脂肪酸β-氧化及乙醛酸循環(huán)等代謝過程密切相關(guān)，影響許多病原真菌的致病性。根據(jù)上述結(jié)果，照光可能對稻曲病菌的致病力有增強(qiáng)作用，后續(xù)可通過接種試驗驗證。
對粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）和裂褶菌（SchizophyllumcommuneFr.）等一些真菌的研究發(fā)現(xiàn)，照光對真菌的影響有可能通過光受體介導(dǎo)。目前已鑒定到一些光受體，如感應(yīng)藍(lán)光的WC-1（white collar-1）和WC-2（white collar-2），感應(yīng)紅光及遠(yuǎn)紅光的光敏色素和視紫紅質(zhì)等。WC-1具有LOV感光結(jié)構(gòu)域，通過該結(jié)構(gòu)域可以直接感受光信號的刺激。WC-1可與WC-2形成復(fù)合物，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而調(diào)控真菌的生長與產(chǎn)孢。不同的真菌中，WC-1可能具有不同的靶標(biāo)基因。蛹蟲草菌（Cordyceps militaris）不管是否受到照光，其WC-1光受體蛋白都有一定量的表達(dá)，但若受到照光，表達(dá)量會明顯增多，然后逐漸減少。迄今尚未見到任何關(guān)于稻曲病菌光受體的研究報道。本試驗從黑暗組與照光組稻曲病菌菌絲中均檢測到1個與粗糙脈孢菌WC-1編碼基因具有較高同源度的基因（UVI_02002710）的表達(dá)，但在2組菌絲中該基因的表達(dá)量無明顯差異，因此不屬于DEG，表明該基因與照光抑制稻曲病菌菌絲的生長可能無關(guān)。是否有其他光受體參與到照光對稻曲病菌菌絲的生長調(diào)控中，仍有待研究。
4、結(jié)論
在培養(yǎng)稻曲病菌的過程中對菌落的觀測結(jié)果顯示，照光可抑制菌絲的生長，光照條件是稻曲病菌菌絲的一種生長調(diào)控因子。采集黑暗組與照光組菌絲，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較2組菌絲的轉(zhuǎn)錄組后得到695個DEGs，其中359個被照光上調(diào)表達(dá)，336個被照光下調(diào)表達(dá)。對DEGs進(jìn)行GO富集分析的結(jié)果顯示：生物過程、細(xì)胞成分和分子功能這3大類別都有DEGs富集，說明照光抑制稻曲病菌菌絲的生長涉及復(fù)雜的機(jī)制。對DEGs進(jìn)行KEGG通路注釋的結(jié)果表明，照光抑制稻曲病菌菌絲的生長可能主要與核糖體結(jié)構(gòu)和功能，以及氨基酸代謝受到影響有較大關(guān)系。DEGs包含1個ACS編碼基因且照光顯著抑制其表達(dá)，推測削弱菌絲的乙酰輔酶A合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌絲生長的機(jī)制之一。DEGs未包含UvHOG1和UvBI-1基因，因此，照光抑制稻曲病菌菌絲的生長與蛋白激酶HOG1及BI-1無關(guān)。