摘要：腸道微生物群在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。然而，腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物參與膿毒癥過程的具體機制仍不清楚，這限制了其轉(zhuǎn)化應用。本文采用微生物組學和非靶向代謝組學相結合的方法對入院的膿毒癥患者的糞便標本進行分析，篩選出可能對疾病轉(zhuǎn)歸起重要作用的微生物群、代謝物和潛在的信號轉(zhuǎn)導途徑。最后，通過對膿毒癥動物模型的微生物組和轉(zhuǎn)錄組分析對上述結果進行驗證。膿毒癥患者表現(xiàn)出共生菌群破壞和腸球菌豐度增加，擬桿菌（尤其是普通擬桿菌）負擔較重的患者，APACHE II評分更高，且ICU停留時間更長。CLP大鼠腸道轉(zhuǎn)錄組表明，腸球菌和擬桿菌與差異表達基因具有不同的相關性，表明這些細菌在膿毒癥中的作用截然不同。此外，與健康對照組相比，膿毒癥患者的腸道氨基酸代謝紊亂，其中，色氨酸代謝與微生物群改變和膿毒癥嚴重程度密切相關。腸道微生物和代謝特征的改變與膿毒癥的進展相一致，有助于預測膿毒癥早期患者的臨床結果，并為探索新的治療方法提供轉(zhuǎn)化基礎。
研究背景：膿毒癥是一種嚴重感染導致宿主劇烈炎癥反應的疾病，是一種全球范圍內(nèi)危及生命的疾病。在某些情況下，膿毒癥會發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，導致預后惡化。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)與膿毒癥等多種疾病的發(fā)病機制之間存在密切的相互作用。先前很多研究主要關注膿毒癥患者的微生物特征，但在膿毒癥中發(fā)生改變的細菌作用機制仍不清楚。膿毒癥的代謝特征已在血清中確定，但膿毒癥期間腸道的代謝變化尚不清楚。膿毒癥的代謝特征已在血清中確定，但期間腸道的代謝變化尚不明確。因此，為了闡明膿毒癥中腸道微生物群和代謝物的組成及其與疾病進展的關系，我們對重癥監(jiān)護病房(ICU)收治的膿毒癥患者進行了一項觀察性隊列研究。入院時收集的糞便樣本用于生成微生物和代謝譜。此外，我們還建立了膿毒癥大鼠模型，以反映腸道基因表達特征并驗證患者的微生物特征。這項研究將揭示膿毒癥相關菌群的潛在生物學功能，為更早地預測和改善這種危險疾病提供理論基礎。
整體研究思路
研究方法
研究設計和樣本收集
本研究為描述性觀察性研究，研究對象為來自中國一家中心（上海）的患者。膿毒癥的定義符合第三屆國際膿毒癥和感染性休克共識（spesis 3）的建議。排除患有絕癥的以及接受結腸造口術或回腸造口術的患者。經(jīng)過測序質(zhì)量過濾后，在微生物群比較中納入了38名膿毒癥患者和19名HC（圖1A）。對驗證組的代謝組進行單獨分析，僅在該組中檢測到的功能差異代謝物被確定為膿毒癥相關代謝物,只有在驗證組中確認的顯著相關性才被定義為可靠的相關性（圖1B、C）。
樣本采集和處理
排便后立即采集患者的糞便樣本，-20°C冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80°C冰箱中長期保存。每份樣本分成兩部分：一部分通過16S rRNA測序進行腸道微生物組分析，另一部分通過非靶向液相色譜-質(zhì)譜分析（LC/MS）進行腸道代謝組學分析。
CLP模型和RNA測序
在麻醉大鼠上建立CLP膿毒癥模型，用1.5%戊巴比妥麻醉大鼠（0.5 mL/100 g體重），在腹部正中做2.5 cm的切口。在距盲腸末端1.5 cm處結扎，用14號針頭穿刺兩次。將盲腸放回腹腔后關閉腹壁。假手術大鼠接受相同程序，但不結扎和穿刺。在膿毒癥誘導24小時后，所有大鼠均被殺死。收集含有糞便的結腸段，立即儲存在?80°C，隨后用于16S RNA測序以檢測腸道。此外，收集從大鼠固定位置取下的遠端回腸和結腸組織，用生理鹽水輕輕沖洗，儲存在-80°C用于轉(zhuǎn)錄組檢測。
統(tǒng)計學分析
臨床指標
結果連續(xù)變量以平均值和標準差表示，分類變量以頻率和百分比表示。使用學生t檢驗比較年齡和ICU住院時間的差異。通過Fisher精確檢驗比較APACHE II評分≥18、SOFA評分≥10和ICU住院天數(shù)≥30的比例以及腸型之間的病死率。這些分析通過GraphPad Prism 9進行分析。
腸道微生物群
使用t檢驗在操作分類單元(OTU)水平比較腸道菌群的alpha多樣性(Shannon和Chao指數(shù))。進行Bray–Curtis距離度量的主坐標分析(PCoA)以反映每個樣本的微生物結構，并通過相似性分析(ANOSIM)檢驗揭示差異。為了評估協(xié)變量對膿毒癥患者菌群的潛在影響，我們通過IBM SPSS Statistics 24.0使用學生t檢驗或Wilcoxon檢驗比較各組的Shannon指數(shù)、主成分(PC)1和PC2、腸球菌OTU808載量和擬桿菌OTU773載量。從科水平到OTU水平評估線性判別分析效應大小(LEfSe)，并在不同條件下設置不同的線性判別分析(LDA)評分閾值。使用Wilcoxon檢驗對各組間優(yōu)勢分類群進行比較，使用Spearman相關性分析OTU豐度與臨床參數(shù)或基因表達水平之間的相關性，通過多元線性回歸分析OTU773相對豐度與ICU住院天數(shù)之間的相關性。
腸道代謝物
進行Wilcoxon檢驗和倍數(shù)變化分析?；赩IP和Wilcoxon檢驗的p值(VIP的閾值>1，p<0.05)選擇具有顯著差異的代謝物，使用主成分分析(PCA)評估樣本的交互驗證。通過搜索京都基因和基因組百科全書(KEGGhttp://www?；蚪M。jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫來確定差異代謝物的生化途徑，并根據(jù)其途徑參與度進行分類。根據(jù)功能節(jié)點中代謝物的存在進行富集分析。Scipy.stats Python包用于檢驗由Fisher精確檢驗確定的富集途徑的統(tǒng)計顯著性。采用Spearman相關性分析來闡明代謝物豐度、細菌負荷和臨床嚴重程度指標之間的關聯(lián)。此外，為了評估協(xié)變量對膿毒癥患者代謝組的潛在影響，我們使用IBM SPSS Statistics 24.0中的Student's t檢驗比較了負模式和正模式下各組的主成分(PC)1。
腸道轉(zhuǎn)錄組
使用Edger和DESeq2 R軟件包進行差異基因表達分析，并使用帶有錯誤發(fā)現(xiàn)率校正的Kal檢驗。經(jīng)Benjamini-Hochberg校正后，用調(diào)整后的p值<0.05來鑒定差異表達基因(Deg)，分析DEG的功能基團是否參與KEGG通路。生成PCA圖并用于評估其相互作用的變化。為了確定核心DEG，使用相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索工具(STRING)創(chuàng)建一個包含所有DEG的基因相互作用網(wǎng)絡，然后將其導入Cytoscape Software 3.7.0進行可視化，選擇排名靠前的DEG進一步行相關性分析。
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