近年來，由于人口的快速增長(zhǎng)和工業(yè)化進(jìn)程的加速，環(huán)境污染加劇，土壤遭到破壞，尤其是土壤重金屬污染。土壤重金屬污染的污染物在土壤中很難移動(dòng)，滯留時(shí)間較長(zhǎng)，難以被其他微生物降解，并可通過水、植物媒介的傳遞而影響人類生命健康。
為緩解土壤重金屬污染問題，國(guó)內(nèi)外專家曾采用非毒性改良劑法、深耕法、排土法、客土法及化學(xué)沖洗等方法，但受方法的局限性，均未能得到理想的治理效果。近年來，生物學(xué)方法因成本低、能耗小、無二次污染、處理效果好，具有廣泛的應(yīng)用前景。
本文從湖北大冶市某礦區(qū)某植物根際土樣中篩選到1株重金屬抗性菌CL01，并根據(jù)其形態(tài)和16S rRNA基因序列，對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在模擬銅污染土壤中種植紫云英，發(fā)現(xiàn)其具有較好的促進(jìn)紫云英抵抗銅脅迫的作用，通過測(cè)定紫云英的生物量、植株不同部位的含銅量和土壤中不同狀態(tài)銅含量，進(jìn)一步揭示了該細(xì)菌促進(jìn)植物抵抗銅脅迫的機(jī)理，為重金屬污染土壤的微生物修復(fù)提供了重要的理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
752型紫外可見光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），AA1700原子吸收分光光度計(jì)（浙江福立分析儀器有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（博大泰克），2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰科生物技術(shù)有限公司），pMD18-T Vector（寶生物工程大連有限公司），測(cè)定分析所用試劑均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。
氯化銅（CuCl2·H2O）配成所需濃度，一次性拌入供試土壤。供試土壤取自中南民族大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)園，經(jīng)自然風(fēng)干后碾碎過2 mm篩，與洗凈風(fēng)干的砂等質(zhì)量混合?；旌贤寥篮袡C(jī)質(zhì)13.6 g/kg，速效氮58 mg/kg，速效磷19.7 mg/kg，速效鉀205 mg/kg，pH 6.65，有效銅0.43 mg/kg，全銅4.22 mg/kg.將供試土壤121℃滅菌1 h，連續(xù)滅菌2次，備用。
紫云英（Astragalussinicus），本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后離心收集菌體，用無菌水洗滌3次后制成菌懸液，懸液菌濃度約為1×109cfu/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2重金屬抗性細(xì)菌的篩選和抗性水平
取湖北大冶市某礦區(qū)植物根圈的土樣1 g加入含有99 mL無菌蒸餾水并帶有玻璃珠的三角瓶中，放置于37℃搖床（200 r/min）振蕩30 min.靜置后取樣涂布含銅和鉻的Luria-Bertani平板中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待其長(zhǎng)出菌后，挑取菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，LB斜面4℃保存。
分別倒置含不同濃度梯度的重金屬LB平板，接種后于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察菌體生長(zhǎng)情況，檢測(cè)細(xì)菌對(duì)不同重金屬的抗性水平。本實(shí)驗(yàn)所用的重金屬鹽分別為：K2CrO4,ZnSO4·7H2O,CdCl2·2.5H2O,CuSO4·5H2O,NiSO4,MnCl2·4H2O和Pb（C2H3O2）·3H2O。
1.316S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定
取對(duì)數(shù)期的菌液，離心后收集菌體，抽提細(xì)菌基因組的總DNA.以基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA.擴(kuò)增引物選用細(xì)菌的通用PCR引物，正向引物（5′AAGGAGGTGATCCAGCC 3′），反向引物（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′）。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸2 min.循環(huán)30次，72℃延伸10 min。16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用瓊脂糖凝膠回收，再克隆到pMD18-T載體，經(jīng)過抽提質(zhì)粒、酶切和PCR驗(yàn)證后，由北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。
1.416S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析
通過Blast程序，將測(cè)定的序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中己有的16S rDNA序列同源性比較分析，采用Bioedit和MAGE 4.0軟件以鄰位相連（Neighbor-Joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹。選取同源性高的菌株中各個(gè)不同屬的一些代表菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。
1.5盆栽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
將泥土裝入塑料盆中，選顆粒飽滿大小均勻的紫云英種子，用95%乙醇預(yù)處理5min，再用2%次氯酸鈉滅菌30 min，無菌水洗滌8——10次。種子在無菌水中充分吸漲后，均勻鋪于瓊脂平板，22℃倒置催芽2 d，催芽后的種子載入盆中。
實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：無菌無銅、有菌無銅、無菌有銅和有菌有銅，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。有銅組按75 mg/kg土壤一次性加入CuCl2溶液（銅溶液提前20 d加入，塑料盆下放一個(gè)托盤，將盆底流出的液體重新倒入花盆，以防銅流失）。有菌組則在栽種3 d后于根系按每棵植株1mL加入菌懸液。培養(yǎng)過程在智能人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，設(shè)置白晝：20℃，18 h，濕度為70%，光照強(qiáng)度3級(jí)；16℃，6 h,濕度為70%，光照強(qiáng)度0級(jí)。2 d澆1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)35 d后，分根和地上2部分收集植株，并收集根際土壤。
1.6植物生物量和銅含量的測(cè)定
分別測(cè)量紫云英根和地上部分長(zhǎng)度，稱量鮮重。將各部分經(jīng)150℃烘干2 h，75℃下24 h，稱量干重。對(duì)紫云英根和地上部分進(jìn)行消解，獲得上清液用分光光度計(jì)測(cè)定銅含量。提取根際土壤中可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的銅，并用分光光度計(jì)測(cè)定銅含量。
1.7統(tǒng)計(jì)方法
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)的差異顯著性。
2結(jié)果與討論
2.1抗重金屬微生物的篩選和分離
從分離培養(yǎng)基平板中挑取單菌落，經(jīng)過篩選獲得一株能在含CuCl2和K2CrO4均為1 mM的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株CL01.在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)2 d后可見其菌落邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，半透明，呈淺黃色。CL01菌株革蘭氏染色呈陰性，菌體桿狀，無芽孢。
2.2 Y3菌株對(duì)多種重金屬離子的抗性
本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了CuSO4·5H2O，K2CrO4，CdCl2·2.5H2O，ZnSO4·7H2O，NiSO4，MnCl2·4H2O和Pb（C2H3O2）·3H2O等7種重金屬對(duì)CL01菌株的最低抑菌濃度（見表1）。結(jié)果表明：菌株CL01對(duì)不同重金屬離子的抗性各不相同，對(duì)鎘的抗性較弱，僅在含Cd2+濃度1 mmol/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而對(duì)Mn2+和Pb2+的抗性很強(qiáng)，其抗性濃度均達(dá)到了5 mmol/L.另外，菌株對(duì)Cr6+、Zn2+、Cu2+、Ni2+等重金屬離子的抗性濃度也均達(dá)到了2 mmol/L.對(duì)7種重金屬的抗性試驗(yàn)分析表明，菌株CL01具有普遍較高的重金屬抗性能力。
表1菌株CL01對(duì)多種重金屬離子的抗性
2.316S rRNA基因的克隆與序列分析
以菌株CL01的DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得一條約1.5 kb的特異性片度，經(jīng)回收、轉(zhuǎn)化后，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。利用Blast程序，將測(cè)序所得的16S rDNA部分序列和GenBank已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，結(jié)果表明：菌株與Bordetella、Alcaligenes、Achromobacter等屬中多個(gè)種的16S rDNA序列具有高度同源性，與AchromobacterdenitrificansBMB-N6、AchromobacterxylosoxidansCONC18、B.bronchisepticaBb4、B.hinziiAU12584、Alcaligenesdenitrificans等菌的同源性均超過了99%。
2.416S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析
將CL01菌株的16S rDNA部分序列提交GenBank進(jìn)行Blast,下載同源性最高的12株不同屬的細(xì)菌16S rDNA，采用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)后采用MEGA4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖1）。由圖1可見，CL01菌株與Achromobacter菌屬的Achromobacterxylosoxidans細(xì)菌親緣關(guān)系最近，而與Alcaligenes和Achromobacter屬在進(jìn)化上的距離相對(duì)較遠(yuǎn)。依據(jù)前面形態(tài)學(xué)和染色觀察結(jié)果，可判定所分離的重金屬抗性菌株可能為Achromobacterxylosoxidans.在系統(tǒng)發(fā)育地位上則屬于Bacteria，Proteobacteria，Betaproteobacteria，Burkholderiales，Alcaligenaceae，Achromobacterxylosoxidans。
圖1 CL01菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.5銅脅迫下紫云英生長(zhǎng)的測(cè)定
銅是植物生長(zhǎng)必需的微量元素，但過量的銅會(huì)給植物的生長(zhǎng)帶來毒害。在無菌有銅環(huán)境下生長(zhǎng)的紫云英與對(duì)照組（無菌無銅組和有菌無銅組）相比，表現(xiàn)出明顯的外部形態(tài)上的諸如葉片出現(xiàn)斑紋、植株失綠和根系萎縮等明顯的重金屬中毒癥狀?？梢娫摑舛认碌腃u對(duì)紫云英的生長(zhǎng)有抑制作用，這和此前有關(guān)銅離子對(duì)紫云英作用的報(bào)道相一致。而有菌有銅處理下植株的生長(zhǎng)水平顯著提高，其植株地上部分高度為39.33 mm,根長(zhǎng)為57.67 mm,植株鮮重為0.2278 g，達(dá)到了無菌無銅處理下植株的生長(zhǎng)水平，二者均顯著高于無菌有銅處理下植株地上部分高度13.83 mm,根長(zhǎng)12.33 mm,植株鮮重0.0386 g（見圖2），說明CL01能促進(jìn)紫云英抵抗Cu的脅迫作用，提高了紫云英的生長(zhǎng)能力。
圖2不同處理下對(duì)紫云英的生物量的差異
2.6銅含量的測(cè)定
與無銅對(duì)照組相比，加銅條件生長(zhǎng)的紫云英根部銅吸取量顯著增加，表明銅脅迫會(huì)促使加大植株對(duì)銅的攝入量（見表2）。然而，有菌有銅處理植株根部的銅攝取量為0.6 mg/kg,遠(yuǎn)低于無菌有銅對(duì)照處理攝取量1.74 mg/kg，表明CL01的存在顯著緩解了植株對(duì)銅離子的吸收。相比之下，紫云英地上部分所含銅濃度的變化不明顯。說明重金屬被紫云英吸收以后，大部分停留在根部，少量向地上部分遷移。此結(jié)果與已有研究報(bào)道一致。
紫云英根際土壤不同形態(tài)銅，結(jié)果表明：盡管CL01菌株對(duì)有銅處理根際土壤水溶態(tài)銅含量影響較小，有菌有銅處理根際土壤可交換態(tài)含量為2.62 mg/kg，顯著低于無菌有銅處理可交換態(tài)含量4.11 mg/kg（見表2）；而有菌有銅處理根際土壤鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)含量為17.96 mg/kg，高于無菌有銅處理可交換態(tài)含量11.51 mg/kg.根據(jù)植物根對(duì)土壤中重金屬吸收的難易程度，可將土壤中重金屬大致分為可吸收態(tài)、交換態(tài)和難吸收態(tài)3種狀態(tài)。研究表明，土壤溶液中的金屬如游離離子易為植物根所吸收，結(jié)合態(tài)等難以被植物所吸收，而交換態(tài)介于兩者之間，主要包括被粘土和腐殖質(zhì)吸附的重金屬。鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)重金屬是以礦物的外囊物和細(xì)粉散顆粒存在，活性的鐵錳氧化物比表面積大，吸附或共沉淀陰離子而成。
本研究表明：土壤中較高濃度的銅會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，而CL01菌株通過形成較高含量的鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)銅，有效降低了土壤中水溶態(tài)和可交換態(tài)銅含量，減少了植物對(duì)銅的吸取量，并降低了銅對(duì)植物的毒害作用。
表2不同處理對(duì)紫云英植株含銅量和根際土壤銅濃度的影響
根部、可交換態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)同列，與有菌有銅相比：P<0.05
3結(jié)論
（1）本實(shí)驗(yàn)篩選到的菌株CL01具有抗多種重金屬能力，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，判斷該菌屬于Achromobacter.
（2）在模擬銅污染土壤中種植紫云英，發(fā)現(xiàn)其具有較好的促進(jìn)紫云英抵抗銅脅迫的作用。在含銅環(huán)境下，加菌處理植株地上部分高度、根長(zhǎng)、植株鮮重，達(dá)到了無菌無銅處理下植株的生長(zhǎng)水平，二者均顯著高于無菌有銅處理下植株。表明CL01能促進(jìn)紫云英抵抗Cu的脅迫作用，提高紫云英的生長(zhǎng)能力。
（3）測(cè)定了根際土壤中水溶態(tài)、可交換態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)的銅濃度，結(jié)果表明CL01菌株通過形成較高含量的鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)銅，有效降低了土壤中水溶態(tài)和可交換態(tài)銅含量，減少了植物對(duì)銅的吸取量，降低了銅對(duì)植物的毒害作用。
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