2結(jié)果與分析
2.1 PMEC的形態(tài)學(xué)觀察
經(jīng)組合酶消化組織塊法分離PMEC,第1代細(xì)胞大小不等,種類較為雜亂,但能觀察到有部分細(xì)胞貼壁(圖1A);在培養(yǎng)第3代時PMEC與成纖維細(xì)胞混雜生長形態(tài)多為梭狀與多角形(圖1B);當(dāng)傳至第8代時,大部分成纖維細(xì)胞已被去除,保留了較純的PMEC,其形態(tài)多為鵝卵石狀,表現(xiàn)為單層、上皮樣形態(tài),形成單層聚集形島嶼(圖1C);重新復(fù)蘇后的PMEC生長狀態(tài)良好(圖1D)。
A.第1代細(xì)胞,紅框所示為貼壁細(xì)胞;B.第3代細(xì)胞;C.第8代細(xì)胞;D.復(fù)蘇后第8代細(xì)胞。
圖1 PMEC的形態(tài)學(xué)觀察
2.2 PMEC生長曲線的測繪
如圖2所示,PMEC生長曲線呈“S”型,培養(yǎng)1~3 d時處于潛伏期,細(xì)胞生長較為緩慢;培養(yǎng)3~5 d時為對數(shù)生長期,細(xì)胞增殖速度明顯提高;培養(yǎng)7~8 d后進(jìn)入平臺期,細(xì)胞增殖速度大幅度降低。上述結(jié)果表明,本試驗(yàn)條件下分離培養(yǎng)的PMEC生長狀態(tài)良好。
2.3 PMEC中ZO-1蛋白的表達(dá)
IFA結(jié)果可見,ZO-1抗體可與蛋白特異性結(jié)合,細(xì)胞與細(xì)胞之間出現(xiàn)了紅色熒光信號,表明PMEC之間形成良好的緊密連接(圖3)。
圖2 PMEC生長曲線
圖3 PMEC中ZO-1的表達(dá)
2.4 PMEC中CK-18蛋白的表達(dá)
IFA結(jié)果可見,CK-18抗體可與該細(xì)胞特異性結(jié)合,細(xì)胞胞漿出現(xiàn)了綠色熒光信號,表明該細(xì)胞表達(dá)CK-18(圖4)。
圖4 PMEC中CK-18的表達(dá)
2.5 PMEC中CNS2基因的轉(zhuǎn)錄
對PMEC標(biāo)志基因CNS2進(jìn)行RT-PCR檢測,結(jié)果可見該細(xì)胞轉(zhuǎn)錄CNS2基因,且PMEC經(jīng)0.2 mg/L與2 mg/L的催乳素刺激后,CNS2基因的轉(zhuǎn)錄相比對照組均有升高的趨勢。(圖5)。
2.6 PMEC中CNS2蛋白的表達(dá)
Western blot檢測結(jié)果如圖6所示,未經(jīng)催乳素刺激的PMEC表達(dá)的CNS2較少,而催乳素刺激后PMEC表達(dá)的CNS2增多,且隨著催乳素濃度的增大CNS2表達(dá)增加(圖6A)。將催乳素刺激組與陰性對照組蛋白的內(nèi)參歸一化后灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,催乳素刺激組與陰性對照組相比,CNS2蛋白表達(dá)極顯著增加,且隨著催乳素濃度的增加,該蛋白的表達(dá)也存在顯著的增加(圖6B)。
M.DL 100 DNA Marker;1.未經(jīng)催乳素刺激的PMEC;2.0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.從母豬乳汁中提取的總RNA(陽性對照);5.陰性水對照。
圖5催乳素刺激后CNS2基因的轉(zhuǎn)錄
1.未經(jīng)催乳素刺激的PMEC;2.經(jīng)0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.經(jīng)2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.母豬乳汁中提取的蛋白。?表示P<0.05,???表示P<0.001,????表示P<0.000 1。
圖6催乳素刺激后CNS2蛋白的表達(dá)
3討論
近幾年來,國內(nèi)外學(xué)者已成功培養(yǎng)出了多種動物的MEC,如人、小鼠、奶牛、水牛、綿羊、山羊等,但是國內(nèi)對于PMEC分離與培養(yǎng)的研究還比較少。本研究采用組合酶消化組織塊的方法對PMEC進(jìn)行了分離培養(yǎng),并通過形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線測定、IFA、PCR等多種手段對其進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明本研究成功分離了PMEC,且細(xì)胞間形成緊密連接,可用于體外共培養(yǎng)模型的建立。
本研究分離和培養(yǎng)PMEC所用的組合酶消化組織塊法是基于從嚙齒動物身上獲得MEC的方案以及Dahanayaka等分離母豬MEC的方法所制定。組合酶消化組織塊法是使用透明質(zhì)酸酶和膠原蛋白酶聯(lián)合消化豬乳腺組織后獲得PMEC的方法。此方法用時短,采取的組織腺泡發(fā)育越好獲得的上皮細(xì)胞數(shù)目越多,雖會摻雜少量成纖維細(xì)胞,但因成纖維細(xì)胞與PMEC對胰酶的敏感性不同,可在每次傳代時使用胰酶消化的時間不同進(jìn)行純化,進(jìn)而得到純度較高的PMEC。由于慶大霉素可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡),但MEC對慶大霉素具有高度耐藥性。本研究方法在組織消化液和初始培養(yǎng)液中使用慶大霉素(50μg/mL)來培養(yǎng)從新鮮豬乳腺組織分離的PMEC,以利于去除分離細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞。
MEC的鑒定主要以檢測CK-7、CK-8和CK-18為主,其中檢測CK-18較為普遍。CK-18是一種上皮細(xì)胞特有的中間細(xì)絲蛋白,是細(xì)胞骨架的組成成分,該蛋白是上皮細(xì)胞譜系的特異性標(biāo)記物,其廣泛地應(yīng)用于多種動物MEC的鑒定。本研究采用IFA對細(xì)胞中CK-18進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)胞高表達(dá)CK-18。ZO-1作為特征性緊密連接分子的完整膜蛋白,在細(xì)胞間形成單層屏障的過程中起到尤為重要的作用。本研究采用IFA對分離的PMEC進(jìn)行ZO-1檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間高表達(dá)ZO-1,表明PMEC間可以形成緊密連接,為體外共培養(yǎng)模型的建立奠定基礎(chǔ)。CNS2是PMEC的特異性標(biāo)志物,CNS2的表達(dá)與哺乳期乳腺產(chǎn)生催乳素有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度催乳素刺激下,可以檢測到CNS2的表達(dá),且其表達(dá)量與催乳素呈劑量依賴性。
本研究成功分離并培養(yǎng)出原代PMEC,可以用于實(shí)驗(yàn)室研究,為未來研究豬乳腺疾病以及人乳腺類疾病提供了可靠的模型。
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