2結(jié)果與分析
2.1噬菌體形態(tài)學(xué)觀察
從采集到的水樣中分離得到一株黃單胞菌噬菌體，根據(jù)圖1-A所示，該噬菌體噬菌斑透明，直徑約1~2 mm。經(jīng)透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察(圖1-B，C)發(fā)現(xiàn)，該噬菌體是一株長尾噬菌體，頭部直徑為(48±3)nm，尾部長度為(166±8)nm。根據(jù)ICTV國際病毒分類方法將其命名為vB_XaS_HDB2(簡稱HDB2)。
圖1噬菌體HDB2的形態(tài)觀察
2.2噬菌體宿主譜測定
方中達(dá)等通過5個最基本的鑒別品種(IR26、Java14、南粳15、Tetep和金剛30)對全國菌系聯(lián)合鑒定，將國內(nèi)黃單胞病菌劃分為I、II、III、IV、V、IX 6個致病型，其中I型菌株有21個，占參試菌株的14.00%;II型菌株有23個，占15.33%;III型菌株有11個，占7.30%;IV型菌株有29個，占19.30%;V型菌株有41個，占27.40%;IX型菌株有25個，占16.67%。本試驗(yàn)使用6個致病型的17株黃單胞菌對HDB2進(jìn)行宿主譜測定。由表1可知，HDB2可以裂解52.9%(9/17)的供試黃單胞菌菌株，其中對Xoo 2068、Xoo 1114、Xoo 1765的裂解效果最好，裂解范圍包括了供試菌株的6個不同分型，說明該噬菌體宿主譜裂解的抗原范圍較廣，具有用于噬菌體雞尾酒研究的潛力。
2.3噬菌體最佳MOI和一步生長曲線
由圖2-A可知，噬菌體HDB2在MOI為0.01時效價(jià)有最大值，因此HDB2的最佳MOI為0.01。以時間為橫坐標(biāo)、噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)繪制噬菌體的一步生長曲線，計(jì)算爆發(fā)量。由圖2-B可知，噬菌體HDB2潛伏期為0~3 h，裂解期為3~5 h，5 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，裂解量為44 pfu cell-1。
圖2噬菌體HDB2的最佳MOI(A)和一步生長曲線(B)
圖(A)中標(biāo)注相同字母代表試驗(yàn)組之間無顯著性差異，不同字母代表試驗(yàn)組之間有顯著差異(P<0.05)。“l(fā)g”表示以10為底的對數(shù)。
2.4噬菌體耐受性測定
由圖3可知，在4、20、30、37、40、50、60℃下水浴1 h，HDB2的效價(jià)無明顯變化，在70℃處理下效價(jià)約降低0.8個lg，80℃條件下噬菌體效價(jià)急劇減少約7個lg，說明HDB2的耐高溫能力較強(qiáng)。HDB2在pH為4~11的范圍內(nèi)效價(jià)基本保持穩(wěn)定，在pH為3時效價(jià)大約減少5個lg，在pH為12時噬菌體完全失活，由此可見HDB2有一定的酸堿耐受性。把HDB2置于245 nm紫外燈下照射30 min，HDB2效價(jià)隨時間的增長而逐步降低，25 min后效價(jià)低至不可檢測，表明HDB2易被紫外線輻射滅活，保證了噬菌體應(yīng)用的安全性。綜上所述，HDB2是一株耐高溫、耐酸堿、對紫外線較敏感的噬菌體，具有較好的應(yīng)用潛力。
圖3噬菌體HDB2的溫度耐受性(A)，pH耐受性(B)和紫外耐受性(C)
圖A、B中標(biāo)注相同字母代表試驗(yàn)組之間無顯著性差異，不同字母代表試驗(yàn)組之間有顯著差異(P<0.05)?！發(fā)g”表示以10為底的對數(shù)。
2.5噬菌體基因組分析
HDB2是一株基因組長為43，697 bp、GC含量為54.31%的線性雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體。使用GCView對基因組進(jìn)行可視化(圖4-A)發(fā)現(xiàn)，HDB2預(yù)測有52個開放閱讀框(open reading frame，ORFs)，其中30個被注釋為已知功能的蛋白(57.69%)，分為4個功能域，分別是DNA代謝模塊、裂解模塊、包裝模塊、結(jié)構(gòu)模塊，其中16個為結(jié)構(gòu)模塊相關(guān)基因，8個為DNA代謝相關(guān)基因，4個為裂解基因和2個為包裝模塊相關(guān)基因;剩余的22個ORFs為未知功能的假定蛋白，這些蛋白互相配合，完成噬菌體復(fù)制、裂解宿主釋放子代的過程。使用在線數(shù)據(jù)庫對噬菌體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HDB2含有一個tRNA編碼基因，不存在毒力基因、耐藥基因，能夠確定HDB2是一株烈性噬菌體，并且其具有應(yīng)用的安全性。
圖4噬菌體HDB2的全基因組可視化圖(A)與ANI熱圖(B)
圖A不同顏色代表不同功能的開放閱讀框:未知功能的假定蛋白(藍(lán)色)，裂解模塊(紫色)，特殊模塊(紅色)，包裝模塊(粉色)，結(jié)構(gòu)模塊(棕色)。圖B顯示了不同噬菌體在基因組水平上的相似性，相似性取值范圍為0~1，顏色越紅，表示相似性越高。
將噬菌體HDB2在NCBI進(jìn)行BLASTn比對發(fā)現(xiàn)，HDB2基因組與Septimatrevirus屬噬菌體vB_ Xar_IVIA-DoCa8(ON932082.1)、vB_Xar_IVIA-DoCa1(NC_069745.1)及vB XooS NR08(OQ055246.1)核苷酸序列相似性較高，分別為97.93%、97.89%、97.55%，其覆蓋度分別為95%、96%、97%。平均核苷酸相似度(average nucleotideidentity，ANI)是在核苷酸水平上比較2個基因組親緣關(guān)系的指標(biāo)。ANIm熱圖不同顏色代表不同ANI數(shù)值，顏色越紅代表相似度越高。由圖4-B可知，HDB2與黃單胞菌噬菌體vB_Xar_IVIA-DoCa8的ANI值最高，為97.74%，初步推斷HDB2為Septimatrevirus屬噬菌體。
2.6噬菌體蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖與系統(tǒng)發(fā)育樹分析
利用vConTACT2.0從蛋白質(zhì)水平研究噬菌體之間的親緣關(guān)系。選取Millardlab數(shù)據(jù)庫病毒序列合集進(jìn)行共享網(wǎng)絡(luò)分析。蛋白網(wǎng)絡(luò)圖每個節(jié)點(diǎn)代表一個病毒，節(jié)點(diǎn)之間的連線顯示了病毒簇之間的相關(guān)性，圖5-A黑色圓圈表示HDB2所在位置，圖5-B中不同形狀代表不同宿主的噬菌體，不同顏色代表不同的病毒集群。圖中共有19，790個節(jié)點(diǎn)和911，802條連線，代表了19，790個噬菌體之間的911，802個關(guān)系。HDB2位于VC7890病毒簇，與其中的42株噬菌體均具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。HDB2與其中的vB_Xar_IVIA-DoCa8、vB_Xar_IVIA-DoCa11等32個噬菌體都被歸于同一個屬(Septimatrevirus)。有10個噬菌體暫未有明確分屬，剩下的1個噬菌體被劃分為Kilunavirus屬。通過系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步了解HDB2與其他噬菌體的親緣關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育樹由結(jié)點(diǎn)(node)和進(jìn)化分支(branch)組成，每一結(jié)點(diǎn)代表一個分類單元，而結(jié)點(diǎn)之間的線段長度和角度可以反映物種間的進(jìn)化距離和時間，較長的線段表示物種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而較短的線段表示物種間親緣關(guān)系較近。對HDB2的末端酶大亞基進(jìn)行BLASTp比對后，選取末端酶大亞基相似度較高的25株噬菌體構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5-C可知，HDB2與黃單胞噬菌體Samson(YP_010597508.1)位于同一進(jìn)化分支，均屬于Septimatrevirus屬。綜上所述，HDB2屬于Septimatrevirus屬的成員。
圖5噬菌體HDB2蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(A，B)和系統(tǒng)發(fā)育樹(C)
蛋白網(wǎng)絡(luò)圖由19，790個噬菌體(節(jié)點(diǎn))和911，802個關(guān)系(連接線)組成，圖A中黑色圓圈代表HDB2所在位置，圖B表示HDB2所在的蛋白簇，不同顏色的節(jié)點(diǎn)代表不同宿主的噬菌體，不同形狀代表不同的種屬。圖C中不同結(jié)點(diǎn)代表不同的種屬的噬菌體，線段長度對應(yīng)進(jìn)化距離。
2.7噬菌體抑制黃單胞菌試驗(yàn)
根據(jù)不同MOI加入相應(yīng)效價(jià)的噬菌體作為試驗(yàn)組，通過混合液細(xì)菌濃度(OD600的吸光值)的變化評估HDB2對宿主菌Xoo 2068的防控效果。由圖6可知，不同MOI下，HDB2抑菌能力具有一定差異。在前12 h內(nèi)，各組的OD600值無明顯變化;12~48 h，對照組的黃單胞菌進(jìn)入對數(shù)生長期，OD600逐步增長。MOI為100、10、1、0.1時，試驗(yàn)組細(xì)菌在前24 h時生長趨勢與對照組一致，但在24~36 h時細(xì)菌濃度逐漸降低，36 h時細(xì)菌濃度降到最低;36 h后細(xì)菌濃度再次增加，48 h時這4個試驗(yàn)組OD600值仍然低于對照組，說明在這4個MOI下，HDB2對宿主菌有較好的抑制效果，且MOI越高，抑制效果越明顯。MOI為0.01時，雖然細(xì)菌濃度也出現(xiàn)了先增后降的趨勢，但36 h時細(xì)菌生長速度加快，與對照組OD600差異不明顯，說明HDB2在MOI為0.01時雖然對Xoo 2068有一定的抑制作用，但不如高M(jìn)OI的抑菌效果。噬菌體在MOI較低(0.001、0.0001)時，細(xì)菌生長趨勢與對照組對比未見差異，說明低MOI對細(xì)菌幾乎沒有抑制作用。因此認(rèn)為使用高濃度的HDB2會對黃單胞菌有更好的抑制效果。
圖6噬菌體HDB2對黃單胞菌Xoo 2068的抑制效果
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