2.3抑菌物質(zhì)效價(jià)計(jì)算公式
Nisin濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,線性擬合方程為:Y=1.179 3+5.177 1X(R2=0.928)。根據(jù)此方程可計(jì)算抑菌試驗(yàn)中乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌素當(dāng)量對(duì)數(shù)值[lg(mg/mL)]。由于乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)10倍濃縮,且商品化Nisin效價(jià)單位為900 IU/mg,最終計(jì)算公式為:
乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)效價(jià)(IU/mL)=10X/10×Nisin效價(jià)單位(900 IU/mg)。
圖5 Nisin濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.4分離乳酸菌的抑菌活性及抑菌物質(zhì)效價(jià)
對(duì)分離的乳酸菌F3-1①、N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①以及屎腸球菌5號(hào)株、戊糖乳桿菌12號(hào)株,通過(guò)牛津杯法對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。由圖6可知,在相同條件下,N3-1①產(chǎn)生的抑圈菌直徑最大,達(dá)到了22.68 mm,具有最強(qiáng)的抑菌活性;F3-1①、屎腸球菌5號(hào)株、戊糖乳桿菌12號(hào)株、N4-1①、N5-1①、N7-1①具有一定的抑菌活性。根據(jù)抑菌物質(zhì)效價(jià)公式,計(jì)算出各菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)效價(jià),見(jiàn)表2。結(jié)果表明,糞腸球菌N3-1①具有最高的抑菌物質(zhì)效價(jià),數(shù)值為1.28×106 IU/mL;其次為戊糖乳桿菌12號(hào)株,抑菌物質(zhì)效價(jià)達(dá)到了1.21×105 IU/mL;再次為屎腸球菌5號(hào)株,抑菌物質(zhì)效價(jià)達(dá)到了3.58×104 IU/mL。
圖6不同乳酸菌抑菌作用觀察F3-1①:糞腸球菌;N3-1①:糞腸球菌;N4-1①:屎腸球菌;N5-1①:屎腸球菌;N7-1①:未知菌株;5:屎腸球菌5號(hào)株;12:戊糖乳桿菌12號(hào)株;MSR:MSR肉湯培養(yǎng)基;ddH2O:雙蒸水。下圖同。
表2不同乳酸菌抑菌效果大小比較
2.5不同處理下抑菌試驗(yàn)結(jié)果
牛津杯試驗(yàn)表明,在分離的乳酸菌中N3-1①對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213株具有最強(qiáng)的抑菌活性。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)制備不同處理下的N3-1①無(wú)菌發(fā)酵上清液,開(kāi)展進(jìn)一步抑菌試驗(yàn),探究乳酸菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的種類。由圖7和表3可知,N3-1①的無(wú)菌發(fā)酵上清液經(jīng)冷凍干燥、1/10體積濃縮后表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性,抑菌圈直徑達(dá)23.36 mm;經(jīng)NaOH調(diào)pH至6.5左右,抑菌圈消失,表明發(fā)揮抑菌作用的活性物質(zhì)可能為有機(jī)酸類等酸性物質(zhì);本試驗(yàn)未觀察到H2O2在NaOH對(duì)無(wú)菌發(fā)酵上清液的處理中發(fā)揮進(jìn)一步的作用。
圖7 N3-1①在不同處理下的抑菌作用觀察
表3 N3-1①在不同處理下的抑菌效果比較
2.6不同pH乳酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果
抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①、戊糖乳桿菌5號(hào)株按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)24 h后,無(wú)論是否經(jīng)過(guò)NaOH處理,上述乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液(未經(jīng)過(guò)1/10體積濃縮)經(jīng)牛津杯檢測(cè)未能觀察到抑菌現(xiàn)象(圖8)。由表4可知,除N3-1①無(wú)菌發(fā)酵上清液pH為4.1外,其余4株乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液pH均為3.8,該結(jié)果表明乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液pH高于3.8時(shí),不能有效抑制指示菌金黃色葡萄球菌ATCC29213株的生長(zhǎng)。將乳酸溶液采用滅菌蒸餾水稀釋至4個(gè)不同的pH,分別為1.4、2.1、3.0、3.8,采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果(表5)顯示,當(dāng)pH為1.4時(shí),乳酸溶液對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213株表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用;當(dāng)pH為2.1時(shí),乳酸溶液對(duì)指示菌表現(xiàn)出一定的抑制作用;當(dāng)pH為3.0和3.8時(shí),沒(méi)有觀察到乳酸溶液對(duì)指示菌的抑制作用。
圖8 NaOH處理及乳酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果F:未經(jīng)NaOH處理;C:經(jīng)NaOH處理。
表4 5株乳酸菌在NaOH處理下的抑菌作用
3討論
本試驗(yàn)從牛糞、羊瘤胃內(nèi)容物及青貯飼料中總計(jì)分離出了29株細(xì)菌,其中來(lái)自牛糞的疑似大腸桿菌18株,來(lái)自羊瘤胃內(nèi)容物的疑似乳酸菌9株,來(lái)自青貯飼料的疑似乳酸菌2株。我們通過(guò)NCBI序列比對(duì)鑒定出細(xì)菌的種屬,挑選生長(zhǎng)性能較好的4株疑似乳酸菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①分離純化后對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏鏡檢,顯示均為革蘭氏陽(yáng)性菌株,過(guò)氧化氫酶接觸試驗(yàn)均為陰性。
牛津杯雙層平板法試驗(yàn)結(jié)果表明,從羊瘤胃內(nèi)容物中分離的糞腸球菌N3-1①具有最強(qiáng)的抑菌活性,其他試驗(yàn)菌株培養(yǎng)24 h后的無(wú)菌發(fā)酵上清液所形成的抑菌圈直徑較小,具有一定的抑菌活性。何江波等從羊瘤胃內(nèi)容物中分離出22株乳酸菌(包括戊糖乳桿菌、糞腸球菌、蒙氏腸球菌、海氏腸球菌等),在排除酸效應(yīng)后,所有菌株發(fā)酵上清液均未檢測(cè)到抑菌活性。本試驗(yàn)所得結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。
Korhonen等證明,乳酸菌中發(fā)揮主要抑菌作用的是乳酸和醋酸,與本研究的結(jié)果有相似之處。研究顯示,乳酸菌產(chǎn)酸能力強(qiáng),能快速產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸,形成低pH環(huán)境,抑制有害菌的生長(zhǎng)。陳宏偉等研究表明,乳酸菌通過(guò)細(xì)菌素發(fā)揮主要抑菌作用,在乳酸形成的有機(jī)酸性環(huán)境中,細(xì)菌素發(fā)揮的效果更好。有研究表明,乳酸菌可通過(guò)細(xì)菌素、H2O2等發(fā)揮抑菌效果。
有機(jī)酸可以通過(guò)酸(未電離形式)的擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜,解離和酸化細(xì)胞質(zhì)。此外,解離的有機(jī)酸也會(huì)使細(xì)菌的酶、蛋白質(zhì)和DNA變性,從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。李雪莉等研究表明,乳酸菌主要通過(guò)有機(jī)酸來(lái)發(fā)揮抑菌作用。葉青對(duì)云南建水酸漿豆腐中是乳酸菌進(jìn)行了分離與鑒定,研究發(fā)現(xiàn)酸漿中主要微生物自然發(fā)酵后的有機(jī)酸產(chǎn)物主要為L(zhǎng)-乳酸。我們后續(xù)將對(duì)上述有抑菌活性的乳酸菌作進(jìn)一步研究,以明確其主要抑菌物質(zhì)。
4結(jié)論
本試驗(yàn)從羊瘤胃內(nèi)容物中分離出了1株對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213株有良好抑菌活性的乳酸菌——糞腸球菌N3-1①,其發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)為有機(jī)酸類。通過(guò)不同pH乳酸抑菌試驗(yàn)得出乳酸對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213株發(fā)揮抑菌作用的最適pH為1.4~2.1。
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