2結(jié)果與分析
2.1 Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點鑒定結(jié)果
在D.zeae MS1的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中篩選到XT20、C45、XT120和Q63這4個毒力減弱突變體，突變體基本喪失致病性(Tn5插入sucA基因突變體對香蕉的毒力變化，已提交至國家微生物科學數(shù)據(jù)中心，編號為NMDCNMDCX0001751，https://nmdc.cn/resource/attachment/detail/NMDCX0001751)。該4個Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體在剛果紅-考馬斯亮藍培養(yǎng)基上表現(xiàn)出較為相似的表型，相較于野生型，均表現(xiàn)菌落變小、邊緣平滑且顏色變淺(Tn5插入sucA基因突變體在剛果紅-考馬斯亮藍平板上的菌落形態(tài)變化，編號為NMDCNMDCX0001751)。使用突變體的基因組DNA進行TAIL-PCR擴增、測序發(fā)現(xiàn)，Tn5轉(zhuǎn)座子在該4個突變體中均是插入了同一個基因sucA的不同位點：XT20，第1 870 bp；C45，第1 923 bp；XT120，第2 241 bp；Q63，第2 373 bp(圖1A)。在D.zeae MS1基因組中，sucA基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)長度為2 808 bp，編碼935 aa組成的α-酮戊二酸脫氫酶組分；該基因與D.dadantii 3937菌株的sucA基因序列具有89%的同源性。sucA基因廣泛分布于腸桿菌目不同科的細菌中，SucA蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明迪克氏菌屬(Dickeya)菌株和果膠桿菌屬(Pectobacterium)菌株的遺傳距離最近且可聚成一個遺傳分支，該遺傳分支與歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)等的代表性菌株可明顯得到區(qū)分(圖1B)。
圖1 Tn5轉(zhuǎn)座子插入的sucA基因及其系統(tǒng)發(fā)育樹分析A：示意圖顯示Tn5轉(zhuǎn)座子插入D.zeae MS1 sucA基因的不同位點，黑色箭頭從左至右分別表示突變體XT20、C45、XT120和Q63的插入位點；B：基于SucA蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株拉丁名后括號內(nèi)是GenBank序列號，分支點上的數(shù)字代表該其bootstrap值(以百分比形式展示)，標尺數(shù)字代表該長度的分支所代表的基因遺傳變異度。
小結(jié)
TAIL-PCR鑒定出4個D.zeae MS1的毒力減弱突變體的轉(zhuǎn)座子插入位點均是位于α-酮戊二酸脫氫酶基因sucA內(nèi)，該基因編碼三羧酸循環(huán)過程的關(guān)鍵酶組分。
2.2 sucA基因突變對α-酮戊二酸脫氫酶活性和細菌生長的影響
相較于D.zeae MS1野生型，基因敲除突變體ΔsucA的α-酮戊二酸脫氫酶活性完全喪失，這與該基因預期的生物功能一致；回補菌株C-ΔsucA的α-酮戊二酸脫氫酶活性則可恢復至與野生型相近的水平(圖2A)。在對細菌生長的影響方面，研究發(fā)現(xiàn)ΔsucA在LB培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長密度較野生型和回補菌株表現(xiàn)出一定程度的降低；在生長平臺期時ΔsucA培養(yǎng)物的OD600為1.50?1.60，野生型和C-ΔsucA的OD600分別為2.06?2.20和1.95?2.08(圖2B)。當細菌在MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，ΔsucA在前期表現(xiàn)出一定程度的生長延遲；在生長14 h后達到生長平臺期時，ΔsucA達到與野生型和C-ΔsucA接近的細菌生長密度(圖2C)。sucA突變可完全破壞D.zeae MS1的α-酮戊二酸脫氫酶活性，但僅在一定程度上影響細菌生長。
圖2細菌的α-酮戊二酸脫氫酶活性和生長曲線A：D.zeae MS1野生型、基因敲除突變體ΔsucA和回補菌株C-ΔsucA的α-酮戊二酸脫氫酶活性差異；B：細菌在LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的生長曲線差異；C：細菌在MM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的生長曲線差異。
小結(jié)
基因敲除突變體ΔsucA在細菌生長曲線上受到一定程度的影響，但是其α-KGDH活性完全喪失。
2.3 sucA基因突變降低PCWDEs的分泌
相較于D.zeae MS1野生型，ΔsucA在測定平板培養(yǎng)后的Cel、Pel和Prt的活性分別降低了44.25%、40.60%和97.48%，差異達到顯著水平(P<0.05)；C-ΔsucA菌株則將PCWDEs活性恢復至與野生型相似的水平(圖3A?3C)。sucA基因?qū)τ谙憬都毦攒浉【置赑CWDEs具有重要作用，RT-qPCR分析也表明sucA基因突變可影響編碼PCWDEs基因的轉(zhuǎn)錄表達。相較野生型，編碼Pel的基因pelB和pelC在ΔsucA中的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低；但是，sucA基因的突變對編碼Cel的bglA和celH基因、編碼Prt的prtE和prtF基因的轉(zhuǎn)錄表達均不產(chǎn)生明顯的抑制作用(圖3D)。
圖3植物細胞壁降解酶分泌及相關(guān)基因表達的差異A：D.zeae MS1野生型、基因敲除突變體ΔsucA和回補菌株C-ΔsucA的纖維素酶活性；B：果膠裂解酶活性；C：蛋白酶活性；D：植物細胞壁降解酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達，blgA和celH編碼Cel，pelB和pelC編碼Pel，prtE和prtF編碼Prt。
2.4 sucA基因突變不影響細菌運動性
在細菌運動性方面，D.zeae MS1野生型表現(xiàn)出良好的涌動性和游動性。相較于野生型，ΔsucA的涌動性和游動性均表現(xiàn)出相似的運動水平，回補菌株C-ΔsucA也呈現(xiàn)與它們相似的細菌運動能力(圖4)。sucA基因的敲除突變并未降低細菌的涌動性和游動性。
圖4細菌運動性A：涌動能力；B：游動能力。
小結(jié)
sucA基因突變可顯著減少PCWDEs的分泌并降低pelB和pelC等基因的轉(zhuǎn)錄表達，而不影響細菌的涌動、游動能力。
2.5 sucA基因突變可影響細菌的毒力
在對非寄主煙草的過敏性反應上，D.zeae MS1野生型在浸潤接種至煙草葉片后可產(chǎn)生組織壞死等典型的過敏性反應，接種ΔsucA的煙草葉片僅表現(xiàn)出微弱的過敏性反應，兩者間的反應差異明顯(圖5A)；C-ΔsucA可恢復突變體在煙草上誘導產(chǎn)生過敏性反應的能力。在對寄主香蕉的致病性反應上，接種D.zeae MS1野生型和C-ΔsucA的香蕉幼苗在3 d后均可呈現(xiàn)出細菌性軟腐病癥狀，具體表現(xiàn)為假莖基部變褐和新葉開始失綠；在接種7 d后，多數(shù)香蕉幼苗均已呈現(xiàn)明顯的癥狀，具體表現(xiàn)為假莖腐爛、變黑并出現(xiàn)水漬狀病斑，新葉也表現(xiàn)出明顯枯萎甚至整葉壞死(圖5B)。相反地，接種ΔsucA的香蕉幼苗在7 d后仍然表現(xiàn)整株健康，在接種處未出現(xiàn)明顯的細菌性軟腐病癥狀(圖5B)。接種7 d后，香蕉幼苗發(fā)病嚴重程度的等級劃分表明野生型和回補菌株可引起全部已接種幼苗出現(xiàn)癥狀，7株接種野生型的幼苗達到了3級以上的癥狀，5株接種回補菌株的幼苗達到了3級以上的癥狀；接種ΔsucA的幼苗則均未出現(xiàn)癥狀(0級)(圖5C)。接種野生型和回補菌株的香蕉幼苗的病情指數(shù)分別為62.50%和60.00%，接種ΔsucA的幼苗的病情指數(shù)為0。
圖5細菌的過敏性反應和致病性反應測定A：D.zeae MS1野生型、基因敲除突變體ΔsucA和回補菌株C-ΔsucA接種煙葉24 h后的過敏性反應；B：細菌接種香蕉幼苗7 d后的致病性反應；C：接種7 d后香蕉幼苗發(fā)病嚴重程度分級的分布，0–4代表發(fā)病嚴重程度的不同等級。
小結(jié)
相較于野生型，ΔsucA在煙葉上產(chǎn)生的過敏性反應明顯減弱，對香蕉幼苗的致病性也顯著降低?；匮a菌株則可將上述細菌表型均恢復至與野生型接近的水平。
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