前言
沙門菌(Salmonella)是一種危害較大的食源性致病菌，在自然界中分布廣泛，自1885年首次被分離，嚴(yán)重威脅著人與動(dòng)物的生命健康，沙門菌血清型眾多，已鑒定出超過2 600種沙門菌血清型，但其中腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)和鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)是引起急性胃腸炎主要的血清型，占報(bào)告的沙門菌病例的50%以上[1]。典型癥狀包括發(fā)熱、腹瀉和嘔吐，也是造成嬰幼兒和免疫功能低下患者菌血癥的重要原因，甚至導(dǎo)致患者死亡。
1996—1999年期間，食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(FoodNet)中記錄的人類腸炎沙門菌感染發(fā)生率增加了44%[2]；2019年，在美國(guó)由非傷寒沙門菌引的病例大約有120萬，26 500人住院，420人死亡。美國(guó)因沙門菌引起的食源性疾病估計(jì)成本超過35億美元，因感染沙門菌而住院的患者人數(shù)幾乎是彎曲桿菌的2倍[3]。2017年，歐盟報(bào)告91 662例患者被確診為沙門菌病，167 96人住院，156人死亡[4]。中國(guó)全年因沙門菌引起的胃腸炎大概有9 500多萬，除了諾如病毒，沙門菌在細(xì)菌感染中排全國(guó)第一位。而且腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌及其他沙門菌血清型的耐藥性越來越普遍，如多重耐藥菌株鼠傷寒沙門菌株DT104已在全球范圍內(nèi)擴(kuò)散[5]。
食品加工各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能造成食品的污染，人感染沙門菌病主要是通過食用未煮熟或生食品而引起，其中雞蛋和蛋制品被認(rèn)為是腸炎沙門菌病最重要的來源，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將雞蛋列為與食源性疾病有關(guān)的第二大危險(xiǎn)食品[6]。沙門菌菌株通常很難從其宿主(如禽類動(dòng)物)中消除，因此需要在食品本身，特別是雞蛋等高風(fēng)險(xiǎn)食品中尋找并應(yīng)用有效防治策略[7]。
目前，在控制食品安全方面有許多的滅菌方法，如加熱、紫外線以及抗生素等，傳統(tǒng)方法普遍存在適用范圍有限、成本費(fèi)用高以及安全性低等問題[8]。因此，迫切需要新型抗菌方法來殺滅食源性病原體。噬菌體具有宿主特異性、天然來源、易于分離、低毒性和降解生物膜的潛力等特性[9]，使用其進(jìn)行生物控制可以克服許多傳統(tǒng)滅菌方法的限制且不會(huì)對(duì)食物的自然微生物群或營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生有害影響。噬菌體生物防治已被證明是控制各種食源性病原體的高效方法[10]，因此，合理開發(fā)和利用噬菌體對(duì)食品安全防控具有重要意義。
本研究在污水中分離出腸炎沙門菌的噬菌體，并探究其生物學(xué)特性和基因組生物信息學(xué)，以及對(duì)染菌蛋液殺菌效果，為噬菌體作為食品安全防控制劑控制腸炎沙門菌污染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
方法
通過雙層平板法分離并純化噬菌體，透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)，測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性，對(duì)噬菌體進(jìn)行全基因組測(cè)序并檢測(cè)其裂解細(xì)菌的功效。
結(jié)果
1．腸炎沙門菌的耐藥性分析：以18株腸炎沙門菌作為宿主菌分離噬菌體，它們均為多重耐藥菌株，對(duì)11種抗生素的耐藥性見表1。
表118株腸炎沙門菌對(duì)抗生素的耐藥性
2．噬菌體的分離及其滴度測(cè)定結(jié)果：從污水中分離出1株裂解性腸炎沙門菌噬菌體，命名為JD01。如圖1所示，噬菌體的噬菌斑清晰透亮、呈圓形且無暈環(huán)，直徑為3～4 mm，噬菌體滴度為1×10 9 PFU/ml。
圖1腸炎沙門菌噬菌體JD01形成的噬斑
3．噬菌體宿主范圍的測(cè)定結(jié)果：以18株腸炎沙門菌、19株鼠傷寒沙門菌、10株傷寒沙門菌、20株大腸埃希菌、18株金黃葡萄球菌、4株阪崎克羅諾桿菌、4株蠟樣芽孢桿菌以及12株肺炎克雷伯菌為測(cè)試菌株，共計(jì)105株，測(cè)定噬菌體JD01的宿主范圍。從表2可見，噬菌體JD01僅裂解沙門菌屬的細(xì)菌，其對(duì)腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和傷寒沙門菌裂解率分別為88.9%(16/18)、94.7%(18/19)和80.0%(8/10)，而對(duì)非沙門菌屬的細(xì)菌如大腸埃希菌、金黃葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、蠟樣芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌均不裂解。
表2噬菌體JD01的裂解譜
4．噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定結(jié)果：當(dāng)噬菌體JD01與宿主菌的比例為最佳MOI時(shí)，子代噬菌體的滴度最大，產(chǎn)生的子代噬菌體的數(shù)量最多，如圖2所示，噬菌體JD01的最佳感染復(fù)數(shù)是0.001。
圖2腸炎沙門菌噬菌體JD01的感染復(fù)數(shù)測(cè)定
5．噬菌體一步生長(zhǎng)曲線及暴發(fā)量的測(cè)定結(jié)果：如圖3所示，噬菌體JD01的潛伏期為30 min，裂解期為60 min，平均暴發(fā)量為95 PFU/細(xì)胞。
圖3噬菌體JD01的一步生長(zhǎng)曲線
6．噬菌體穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果
(1)噬菌體熱穩(wěn)定性：噬菌體JD01在50℃時(shí)，保持較好的活性，在暴露于60℃60 min時(shí)，噬菌體活性下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。70℃時(shí)，在10 min內(nèi)急劇下降直至失活，結(jié)果表明噬菌體JD01對(duì)高溫敏感(圖4)。
圖4腸炎沙門菌噬菌體JD01的熱穩(wěn)定性
(2)噬菌體pH穩(wěn)定性：結(jié)果如圖5所示，噬菌體JD01在pH4.0～12.0條件下仍保持原來較高的滴度，在pH<4.0或pH>12.0的條件下完全失活。
圖5腸炎沙門菌噬菌體JD01的酸堿穩(wěn)定性
7．噬菌體形態(tài)學(xué)觀察
噬菌體JD01的頭部直徑約為58 nm并呈二十面體立體對(duì)稱，有一條長(zhǎng)約120 nm的不可收縮尾部，尾末端帶有寬度約17 nm的薄尾板，尾端有5～6個(gè)尖刺(圖6)。從形態(tài)特征上確定與已知的有尾噬菌體綱(Caudoviricete)，Guernseyvirinae科，Jerseyvirus屬的噬菌體形態(tài)基本一致[14]。
圖6腸炎沙門菌噬菌體JD01電鏡下形態(tài)
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