涼粉草是一種傳統(tǒng)藥食兩用植物，生長于中國東南部、東南亞和印度東北部。因其在中國古代民間醫(yī)學(xué)中享有盛譽(yù)，可治療多種疾病，因此也被稱為“神草”。根據(jù)中藥藥典，涼粉草天然富含生物活性多糖和多酚，可用于治療中暑，保護(hù)肝功能。涼粉草多糖（MCP）是一種棕色酸性陰離子雜多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成。由于天然結(jié)合的棕色生物活性物質(zhì)（例如多酚和有機(jī)酸），這些多糖呈現(xiàn)棕色。MCP與這些生物活性化合物的組合，稱為MCP復(fù)合材料(MCPC)，表現(xiàn)出許多健康益處。
MCPC的研究主要集中在宏觀水凝膠，而不是微米或納米凝膠。然而微型水凝膠（微凝膠）比宏觀水凝膠具有更可控的吸收和響應(yīng)釋放特性。對腸-肝軸的研究表明，口服益生菌參與庫普弗細(xì)胞調(diào)節(jié)、內(nèi)毒素易位和腸源性代謝物遷移，有助于在肝損傷中發(fā)揮保肝作用。益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和代謝功能并激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路，從而改善藥物引起的氧化性肝損傷?；畹腁KK或雙歧桿菌比巴氏滅菌形式對肝損傷具有更強(qiáng)的抗炎和抗纖維化作用。
益生菌在加工、儲存和胃腸道條件下面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。具有pH響應(yīng)性的多糖基微凝膠可以保護(hù)益生菌免受刺激性胃酸的侵害，并以可行的形式在腸道中響應(yīng)性地釋放它們。多糖水凝膠是半固體且機(jī)械強(qiáng)度較弱。通常需要額外的交聯(lián)，例如二硫鍵來固化水凝膠。然而將益生菌封裝在機(jī)械強(qiáng)度較高的載體系統(tǒng)內(nèi)非常重要。如果壁材多糖同時(shí)能夠被腸道菌群用作益生元，那就更有利了。
在這項(xiàng)研究中，我們開發(fā)了一種具有腸道反應(yīng)性和粘膜粘附特性的鐵離子交聯(lián)MCP微凝膠，并通過自然結(jié)合的棕色生物活性物質(zhì)的酚醛金屬骨架進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)化。這些微凝膠在酸性條件下具有完整的結(jié)構(gòu)，并且僅在pH中性條件下破裂，可以響應(yīng)地釋放具有高粘膜粘附和定殖的高活性益生菌。棕色生物活性物質(zhì)通過疏水相互作用和氫鍵與多糖（MCPC）天然結(jié)合，并表現(xiàn)出出色的抗炎和抗氧化特性。這些棕色生物活性物質(zhì)是精確的益生元，可以特異性提高體內(nèi)阿克曼氏菌屬的豐度。然后，將益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)裝入棕色生物活性框架強(qiáng)化微凝膠中。與游離AKK和巴氏滅菌AKK相比，MCPC成分和負(fù)載AKK之間具有更強(qiáng)的協(xié)同健康益處。
MCPC微凝膠可以專門向腸道輸送高活性AKK，從而調(diào)節(jié)微生物群平衡并保護(hù)腸道屏障。MCPC微凝膠還將抗氧化棕色生物活性物質(zhì)專門輸送到肝臟中，以減輕肝臟氧化應(yīng)激和炎癥。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
將初始益生菌密度為10 6 CFU mL?1的MCPC/NZ9000在MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）中培養(yǎng)，使用CLSM監(jiān)測益生菌的生長。通過Bioscreen C自動生長曲線分析儀在OD 600 nm處監(jiān)測MCPC/WCFS1的生長。每1小時(shí)獲取OD 600值，共80小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
成功制備了機(jī)械強(qiáng)度高的MCPC微凝膠，該微凝膠通過酚類金屬配位框架穩(wěn)定，用于益生菌和多酚的共同遞送。該微凝膠具有增強(qiáng)的益生菌胃酸保護(hù)、腸道響應(yīng)釋放和粘膜粘附特性的組合。棕色生物活性物質(zhì)天然結(jié)合在MCP多糖上，事實(shí)證明，MCP多糖是提高阿克曼氏菌豐度的精確益生元。MCPC/AKK通過依次在腸道中提供活性AKK并在肝臟中提供棕色抗氧化劑，有效改善APAP誘導(dǎo)的肝損傷。MCPC微凝膠在腸道中的高活性AKK可以恢復(fù)腸道微生物失調(diào)并促進(jìn)SCFA產(chǎn)生，從而增強(qiáng)肝功能，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥，并通過腸肝軸修復(fù)腸道屏障。
圖1、酚醛金屬配位框架穩(wěn)定的涼粉草多糖復(fù)合物(MCPC)微凝膠，用于控制釋放對乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的肝損傷。采用MCP和棕色生物活性物質(zhì)組成的MCPC，通過離子配位制備微凝膠。微凝膠內(nèi)的棕色生物活性物質(zhì)-Fe 3+酚醛金屬骨架為微凝膠提供了機(jī)械結(jié)構(gòu)支撐。MCPC微凝膠表現(xiàn)出胃酸耐受性，有利于益生菌保護(hù)，并根據(jù)腸道pH值釋放益生菌。這有助于益生菌粘附、保留和定植于腸道。當(dāng)微凝膠解離時(shí)，棕色生物活性物質(zhì)依次釋放，吸附的半乳糖片段通過肝細(xì)胞半乳糖受體的識別，促進(jìn)生物活性物質(zhì)進(jìn)入肝臟。腸道中釋放的益生菌和肝臟中的棕色生物活性物質(zhì)的協(xié)同作用有助于減輕APAP引起的小鼠肝損傷。
圖2、MCPC和MCP微凝膠的制備和表征。A)MCPC微凝膠的SEM。B)用羅丹明B染色的MCPC微凝膠的光學(xué)顯微鏡圖像。C)MCP和MCPC微凝膠的SEM和TEM。D)MCPC微凝膠的元素圖譜。E)MCPC、MCP及其微凝膠的z-電位。F)MCP微凝膠的穆斯堡爾譜。G)MCPC和MCP微凝膠的FT-IR光譜。H)納米壓痕力-距離曲線，I)MCPC和MCP微凝膠的楊氏模量。
圖3、評估MCPC、MCP和棕色生物活性物質(zhì)的體外抗氧化、抗炎和細(xì)胞毒性特性。A)總抗氧化能力(T-AOC)，B)DPPH自由基，C)MCPC、MCP和棕色生物活性物質(zhì)的羥基自由基清除能力。D)MCPC、MCP和棕色生物活性物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化活性。使用MCPC、MCP和棕色生物活性物質(zhì)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，以檢查E)IL-1β和F)IL-10的水平。原始246.7細(xì)胞用MCPC、MCP和棕色生物活性物質(zhì)(200μg mL?1)預(yù)處理24小時(shí)。G)MCPC對Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性評估。
圖4、pH響應(yīng)型MCPC微凝膠可實(shí)現(xiàn)腸道響應(yīng)性釋放并增強(qiáng)益生菌的活力。A)CLSM和B)加載NZ9000（紅色）的MCPC微凝膠的SEM圖像。C)CLSM圖像顯示NZ9000在M17肉湯（pH 5.5）中的微凝膠中生長。D)微凝膠對各種益生菌的包封效率。E)Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測試MRS肉湯中游離WCFS1和MCPC/WCFS1的生長曲線(80h)。F)MCPC/NZ9000微凝膠在SGIF中處理前后的熒光圖像。G)活細(xì)胞（綠色）/死細(xì)胞（紅色）活力，H)存活計(jì)數(shù)，I)Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測試游離WCFS1和MCPC/WCFS1在SGF處理前和處理30分鐘后的對應(yīng)的生長曲線((80h))。
圖5、通過與MCPC介導(dǎo)的相互作用增強(qiáng)腸道粘膜粘附和益生菌定植。A)粘膜粘附曲線，B)MCPC和MCP對大鼠腸粘膜的最大分離力(MSF)和總粘附功(TAW)。C)MCPC濃度對粘液粘附益生菌影響的菌落計(jì)數(shù)。D)粘液（用綠色Alexa Fluor 488-WGA標(biāo)記）滲透無紅色和嵌入NZ9000的CLSM 3D圖像。E)FITC標(biāo)記的游離WCFS1或MCPC/WCFS1在胃腸道中的滯留。F)紅色游離NZ9000或MCPC/NZ9000在腸粘液中的分布?？漳c粘液用綠色Alexa Fluor 488-WGA染色，腸絨毛細(xì)胞核用藍(lán)色DAPI染色。G)小鼠糞便中各種AKK的菌落計(jì)數(shù)。
總結(jié)
口服益生菌在加工、儲存和胃腸道惡劣條件下面臨挑戰(zhàn)?；诙嗵堑乃z遞送系統(tǒng)在益生菌保護(hù)方面很有前景，但其半固體且強(qiáng)度較弱，并且往往需要額外的交聯(lián)來固化其結(jié)構(gòu)。研究人員開發(fā)了一種具有腸道反應(yīng)性和粘膜粘附特性的鐵離子交聯(lián)MCPC微凝膠。首先將MCPC分離為MCP和棕色生物活性物質(zhì)，并研究了它們的化學(xué)成分。然后比較了Fe3+交聯(lián)MCPC和MCP微凝膠的理化性能，尤其是機(jī)械強(qiáng)度。研究了負(fù)載益生菌的MCPC微凝膠的胃酸耐受性、腸道pH響應(yīng)性和粘附保留特性。微凝膠成分的益生元作用也在體內(nèi)進(jìn)行了評估。最后，研究了其對急性肝損傷小鼠模型的緩解作用，重點(diǎn)關(guān)注氧化應(yīng)激、炎癥和腸道菌群調(diào)節(jié)。這項(xiàng)研究為應(yīng)用MCPC微凝膠益生菌遞送系統(tǒng)通過腸-肝軸緩解肝臟疾病提供了靈感，提供了一個(gè)強(qiáng)大的基于天然多糖的微凝膠平臺，用于通過腸肝軸控制釋放和靶向輸送具有健康潛力的益生菌。
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