1、材料與方法
1.1菌株和基因
植酸酶appA基因(Uniprot ID:P07102)克隆自大腸桿菌K12，錨定蛋白pGSA基因(ACT52837.1)采用全基因合成(合成基因的載體骨架為pET-30a)，錨定蛋白和植酸酶的融合可參考文獻(xiàn)，融合后的載體為pET-30a-pGSA-appA。其中，錨定蛋白pGSA和乘客蛋白AppA之間需用柔性肽(GGGGSGGGGS)連接，以消除pGSA和AppA之間的干擾，融合后的表面展示蛋白命名為pGSA-appA。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α和一株從黑土中分離的菌株皮氏羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)G3分別作為基因的克隆和表達(dá)宿主，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化通過二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌(Escherichia coli)WM3064作為供體菌進(jìn)行偶聯(lián)轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)。INTEGRATE系統(tǒng)所用載體pSPIN骨架的構(gòu)建步驟可參考文獻(xiàn)。其中，CRISPR間隔區(qū)的Spacer序列(32 nt)用于基因的靶向定位，R end和L end之間的區(qū)域?yàn)镃argo區(qū)(其中包含目的基因)。具體基因和引物序列見表1。
表1本研究使用的基因和引物序列
1.2主要試劑和儀器
卡那霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；二氨基庚二酸，Sigma-Aldrich公司；植酸鈉、細(xì)菌基因組提取試劑盒、土壤速效磷含量檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；超級感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒、Taq酶、Pfu酶，上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。
PCR儀，Bio-Rad公司；其他所需材料可參考文獻(xiàn)。
1.3載體構(gòu)建
本研究使用的最終表達(dá)載體可參考圖1中的pGSA-appA-pSPIN，該載體主要由QCascade(CRISPR區(qū)、Cas基因表達(dá)區(qū))、TnsABC(轉(zhuǎn)座酶表達(dá)區(qū))和Donor(Cargo區(qū))3部分組成。載體構(gòu)建的步驟包括Spacer區(qū)改造、啟動(dòng)子改造和Cargo區(qū)改造，其中植酸酶融合蛋白的啟動(dòng)子為J23119組成型啟動(dòng)子。利用SnapGene軟件構(gòu)建載體圖譜，引物設(shè)計(jì)和無縫克隆模擬也通過該軟件完成。載體的構(gòu)建步驟主要包括載體線性化和無縫連接，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)。
▲圖1 pGSA-appA-pSPIN載體圖譜
1.4載體的接合轉(zhuǎn)移
使用E.coli DH5α擴(kuò)增目的載體pSPIN-pGSA-appA，并通過超級感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒制備E.coli WM3064供體感受態(tài)，隨后將pSPIN-pGSA-appA轉(zhuǎn)化至E.coli WM3064。將攜帶載體的供體菌株WM3064與受體菌R.pickettii G3按照2:1的比例置于含有50μg/mL卡那霉素和50μmol/L DAP的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜(~10 h)，具體過程可參考文獻(xiàn)。利用卡那霉素抗性篩選接合子后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取接合子基因組，并通過引物27F(5?-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3?)和CM2R(5?-CACCCATAAATTGATAATTATCACACCC-3?)對接合子基因進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)可參考文獻(xiàn)完成。
1.5植酸酶活性檢測
植酸酶活性的測定采用改良的磷酸根顯色法，該方法主要通過磷酸根與鉬酸鹽反應(yīng)生成磷鉬酸復(fù)合物，隨后被還原生成藍(lán)色鉬藍(lán)，最后根據(jù)樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中換算磷酸根濃度。
100 mmol/L的NaAc-HAc緩沖液：取4.101 5 g無水乙酸鈉，溶于500 mL蒸餾水中，用乙酸調(diào)節(jié)至pH 6.0。植酸鈉底物溶液：配制6.25 mmol/L的植酸鈉溶液，取1.443 5 g肌醇六磷酸鈉，溶于NaAc-HAc緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。終止液：5%三氯乙酸溶液(5%TCA)。顯色液：將4份試劑A與1份試劑B混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。試劑A：取7.5 g鉬酸銨，溶于400 mL蒸餾水中，加入22 mL濃硫酸，定容至500 mL，配成1.5%的鉬酸銨溶液，4℃保存。試劑B：配制2.7%硫酸亞鐵溶液，取6.75 g十二水硫酸亞鐵，溶于250 mL蒸餾水中，4℃保存。KH2PO4母液(50 mmol/L)：取0.680 5 g KH2PO4固體，溶于100 mL 0.1 mol/L的NaAc-HAc緩沖液中。
取0.1 mL菌液，置于37℃水浴預(yù)熱5 min，加入0.4 mL底物溶液并充分混合，置于37℃水浴反應(yīng)30 min后，加入0.5 mL終止液及0.5 mL顯色液，顯色10 min，檢測OD700數(shù)值。
取0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L的KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)液各0.1 mL，置于37℃水浴預(yù)熱5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取1 mL上述樣品于狹縫比色皿，用分光光度計(jì)測量OD700，根據(jù)分光光度計(jì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6基因修飾菌的酶活性能分析
取對數(shù)生長期(OD600約為0.7)的基因修飾菌液，7 000 r/min離心5 min，去上清后收集菌體。菌體用生理鹽水吹洗3次，將清洗后的菌體重懸于生理鹽水中，制成細(xì)胞密度為1.0×108 CFU/mL的細(xì)胞懸浮液。
設(shè)置不同植酸鈉底物濃度，取0.1 mL上述菌液于37℃水浴預(yù)熱5 min；加入不同濃度的植酸鈉底物溶液0.4 mL，混合均勻后置于37℃水浴反應(yīng)30 min；加入終止液，混勻；加入顯色劑顯色10 min；取1 mL上述樣品于狹縫比色皿，用分光光度計(jì)測量OD700；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取水解后的磷酸根濃度。
取0.1 mL菌液于37℃水浴預(yù)熱5 min，加入0.1 mmol/L的植酸鈉底物溶液0.4 mL，并使用鹽酸和氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37℃水浴反應(yīng)30 min，后續(xù)檢測方法同上。
1.7基因修飾菌對土壤植酸的活化
將500 g過篩黑土土壤與10 mL生理鹽水清洗后的R.pickettii G3菌液(OD600值為1.0)混合均勻后，放入5粒大小均勻的已發(fā)芽大豆種子，每組重復(fù)5次(以無菌的生理鹽水作為對照)。從播種大豆開始，每7天取一次表層土壤，儲存于-80℃冰箱待測。稱取0.1 g過篩土樣，加入1 mL NaAc-HAc緩沖液，1 500 r/min振蕩1 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.1 mL作為待測樣品(空白組將菌液換成緩沖液即可)，按照植酸酶活性檢測方法進(jìn)行操作。土壤植酸酶活性(單位U/g)計(jì)算如公式(1)所示。
土壤植酸酶活性(U/g)=[(A?-A?)×k×L×D]/(M×T×V)(1)
式中：k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，A1和A0分別為反應(yīng)30 min和對照的OD700值，L為提取植酸酶時(shí)加入的緩沖液總體積，D為提取液稀釋倍數(shù)，M為稱取的土樣質(zhì)量，T為反應(yīng)時(shí)間，V為反應(yīng)液的體積。
取不同時(shí)間段的土壤，利用試劑盒檢測土壤速效磷含量，檢測方法可參考試劑盒說明書。使用SPSS 30.0.0進(jìn)行ANOVA分析。
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