水分活度由澳大利亞科學(xué)家Scott于1953年提出，是指產(chǎn)品水蒸氣壓與同溫度下純水蒸氣壓的比值。其在本質(zhì)上可理解為結(jié)合水含量越高，水分活度越低，可用于微生物生長繁殖的水越少。作為微生物可利用水量度的重要參數(shù)，水分活度也是影響微生物生長的關(guān)鍵因素，在食品和化妝品的微生物控制方面已有應(yīng)用。2006年，《美國藥典》1112章節(jié)中已發(fā)布水分活度測定在非無菌制劑中的應(yīng)用指導(dǎo)原則。本研究中參考該指導(dǎo)原則中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所需的最低水分活度（0.95），分別以氯化鈉、葡萄糖和甘油作為水分活度調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的水分活度值在0.90～0.99范圍內(nèi)，測定產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所需的最低水分活度，以為《中國藥典》相關(guān)內(nèi)容的增訂提供參考?，F(xiàn)報道如下。
1材料與方法
1.1儀器、試劑與菌種
儀器：Aqualab 4TE型水分活度儀（美國Meter Group Inc.）；THERMO1378型生物安全柜（賽默飛世爾科技有限公司）；LRH-250型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SX-500型高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）；SQP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為10 mg）。
試劑：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM，北京三藥科技開發(fā)公司，批號為170808）；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC，北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為171108；氯化鈉（批號為20180509），丙三醇（批號為20180223），均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20180110）。
菌種：產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，廣東環(huán)凱生物科技有限公司，編號為ATCC 13124，工作用菌株為第3代）。
1.2方法
不同水分活度培養(yǎng)基的配制：分別以氯化鈉、葡萄糖及甘油作為水分活度調(diào)節(jié)劑，并測定其滅菌后的水分活度值，制備不同水分活度的FTM。以3種水分活度調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量對培養(yǎng)基水分活度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液的制備：將產(chǎn)氣莢膜梭菌轉(zhuǎn)接至FTM中，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋，制備成不同濃度的菌懸液。
定性試驗：按標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制水分活度在0.90～0.99范圍內(nèi)梯度為0.01的系列FTM；同時配制不調(diào)節(jié)水分活度的FTM，作為對照組（T0）。取產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液，分別加入上述FTM中，每管裝量20 mL，使菌液濃度達(dá)到102cfu/mL。各組培養(yǎng)物置（36±1）℃溫度條件下厭氧培養(yǎng)30 d，逐日觀察生長情況，目測判斷，渾濁表明有生長，澄清表明未生長。
定量試驗：通過定性試驗，初步獲得產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同介質(zhì)的FTM中生長所需最低水分活度，選擇最低水分活度附近3個水平，即低于水分活度限值0.01（T1）、水分活度限值（T2）和高于水分活度限值0.01（T3），同時配制不調(diào)節(jié)水分活度的FTM，裝量均為100 mL，接種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液，使菌液濃度達(dá)到102cfu/mL。于（36±1）℃溫度條件下培養(yǎng)，分別于0，2，16，18，20，24，42，48，72，90，120，144 h時以TSC培養(yǎng)計數(shù)。以測得平均菌落數(shù)的對數(shù)值（logcfu）對時間（t，h）作圖，繪制生長曲線，重復(fù)3次。
2結(jié)果
2.1不同介質(zhì)調(diào)節(jié)FTM水分活度的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
由圖1可知，隨著氯化鈉、葡萄糖和甘油質(zhì)量的增加，水分活度呈下降趨勢。相同水分活度時，3種水分活度調(diào)節(jié)劑質(zhì)量差異較大。當(dāng)水分活度為0.98時，每100 mL FTM中分別需要添加氯化鈉3.51 g、葡萄糖13.80 g、甘油9.08 g。
圖1 FTM中3種水分活度調(diào)節(jié)劑質(zhì)量-水分活度標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2定性試驗結(jié)果
以氯化鈉、葡萄糖和甘油為水分活度調(diào)節(jié)劑的FTM中，產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低生長水分活度分別為0.98，0.98，0.95。這與《美國藥典》中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度（0.95）一致。
2.3定量試驗結(jié)果
產(chǎn)氣莢膜梭菌在3種不同水分活度調(diào)節(jié)劑中的生長曲線見圖2。從生長曲線來看，以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)FTM水分活度時，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度均為0.98；以甘油作調(diào)節(jié)劑時為0.95，與定性試驗結(jié)果一致。根據(jù)定性試驗結(jié)果，以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度時，T1，T2，T3應(yīng)分別為0.97，0.98，0.99，但T3與對照組水分活度相同。為保證試驗完整性，并探討產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度限值以下的生長情況，本研究中將氯化鈉和葡萄糖介質(zhì)中T1，T2，T3調(diào)整為0.96，0.97，0.98。
圖2不同介質(zhì)FTM中產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長曲線
由圖2可知，水分活度會影響產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度較高時生長較旺盛，在水分活度較低時生長緩慢，低于一定值時則停止生長甚至死亡。由圖2 A和圖2 B可知，產(chǎn)氣莢膜梭菌在水分活度大于0.98時生長較快，低于0.98時不生長，且3次試驗結(jié)果一致，重復(fù)性良好，表明以氯化鈉和葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度，產(chǎn)氣莢膜梭菌最低生長水分活度為0.98。由圖2 C可知，當(dāng)水分活度為0.96時，生長較快，生長趨勢與對照組相似；當(dāng)水分活度為0.95時，雖有生長現(xiàn)象，但其生長趨勢明顯弱于0.96，表明以甘油調(diào)節(jié)水分活度，產(chǎn)氣莢膜梭菌最低生長水分活度為0.95。
由圖2可知，水分活度與產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌液濃度呈正相關(guān)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)隨水分活度的降低而減少。同時，水分活度為0.98時，氯化鈉的菌液濃度對數(shù)值略低于對照組，葡萄糖的低于氯化鈉；甘油在水分活度為0.95時的菌液濃度對數(shù)值顯著低于對照組，第2次試驗中表現(xiàn)尤為明顯。不同介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度會影響產(chǎn)氣莢膜梭菌生長遲緩期的長短。由圖2 A可知，水分活度為0.98時，產(chǎn)氣莢膜梭菌的遲緩期為0～20 h。由圖2 B可知，水分活度為0.98時，產(chǎn)氣莢膜梭菌的遲緩期為0～40 h，且其生長先短暫停滯，隨著時間的延長生長繁殖逐漸恢復(fù)。由圖2 C可知，當(dāng)水分活度高于0.95時，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長較快，16 h即開始對數(shù)生長期；當(dāng)水分活度為0.95時，產(chǎn)氣莢膜梭菌44 h后開始進入對數(shù)期，遲緩期時間相對較長。表明產(chǎn)氣莢膜梭菌出現(xiàn)臨界生長狀態(tài)，與產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度（0.95）的結(jié)果一致。
3討論
在厭氧培養(yǎng)條件下，以氯化鈉和葡萄糖為水分活度調(diào)節(jié)劑，當(dāng)水分活度低于0.98時，產(chǎn)氣莢膜梭菌停止生長；以甘油為水分活度調(diào)節(jié)劑，當(dāng)水分活度低于0.95時，產(chǎn)氣莢膜梭菌停止生長。其中，產(chǎn)氣莢膜梭菌對甘油最耐受。相同菌液接種量下，甘油的0 h菌落數(shù)對數(shù)值高于葡萄糖，氯化鈉最低。這可能是因為產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭陽性厭氧菌，甘油可作為厭氧菌的一種保存助劑，可在一定程度上促進其生長。
大多數(shù)微生物的代謝活動需要水分子參與，水分活度降低會導(dǎo)致微生物的代謝活性降低。本研究結(jié)果表明，隨著水分活度的降低，產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長活性逐漸受到抑制。由生長曲線可知，產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液濃度的降低，停滯時間的延長，都與水分活度降低呈正相關(guān)。水分活度與微生物的生長密切相關(guān)，是判斷微生物風(fēng)險與控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，但目前微生物污染控制方面的應(yīng)用和研究仍屬罕見。故有必要深入研究水分活度在非無菌藥品微生物檢驗中的應(yīng)用，以縮短藥品放行周期，降低庫存成本和檢測成本。
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