1.3.2隨機(jī)擴(kuò)增多片段DNA（RAPD）試驗(yàn)
待測菌液在4℃下12 000g離心5 min，收集菌體用無菌水重懸，加入玻璃珠，95℃加熱5 min，渦旋震蕩5 min，離心后保留上清為DNA模板，-20℃?zhèn)溆?。?0μL PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 10μL，ddH2O 5μL、隨機(jī)引物S23 1μL，4μL DNA模板。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析。
1.3.3產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的16S rDNA鑒定
DNA模板制備方法同上。16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系50μL：ddH2O 15μL；2×Taq Plus PCR MasterMix 25μL；上游引物27F 1μL；下游引物1492R 1μL；DNA模板8μL。電泳分析檢測菌株單一性，挑選1 500 bp條帶的進(jìn)行序列分析，利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST工具分析比對序列。
1.3.4菌株生長曲線的測定
將活化菌株按1%的接種量接種至生長曲線測定板中，加入200μL MRS培養(yǎng)基。在Bioscreen C生長曲線測定儀中連續(xù)培養(yǎng)48 h，每隔30 min測定吸光度值（OD 600 nm），并繪制出生長曲線圖。
1.3.5胃酸耐受能力測定
參照李堯等方法，將活化好的菌株離心后用無菌PBS洗滌2次，離心棄上清后分別用pH 2.5的MRS液體培養(yǎng)基重懸。取1 mL pH 2.5的MRS菌體重懸液置于9 mL pH 2.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)0、0.5 h和3.0 h后平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌存活率（%）。
1.3.6膽鹽耐受能力測定
膽鹽耐受能力測定參考LEBEER等方法稍作修改，將上述洗滌后菌懸液加入到等體積0.2%豬膽鹽培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)0、0.5、3.0 h后平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌存活率（%）。
1.3.7產(chǎn)胞外多糖能力測定
利用苯酚硫酸法測定發(fā)酵液中胞外多糖含量。
1.3.8表面疏水性能力測定
將1 mL二甲苯加入3 mL菌懸液中，震蕩旋轉(zhuǎn)120 s，37℃培養(yǎng)箱靜止120 min，分離有機(jī)相和水相。去除有機(jī)相，以PBS為對照，在600 nm處測定水相的吸光度。疏水性百分比計(jì)算方法如下。
疏水性（%）=（A0-At）/A0×100%
式中：A0為初始時OD 600 nm值；At為反應(yīng)后OD 600 nm值。
1.3.9自聚集能力測定
將4 mL菌懸液震蕩旋轉(zhuǎn)120 s，在室溫（37℃培養(yǎng)箱）下孵育5 h，取1 mL上層清液，測定OD 600 nm吸光度。自聚集百分比計(jì)算方法如下。
自聚集（%）=（1-At/A0）×100%
式中：A0為初始時OD 600 nm值；At為靜止后OD 600 nm值。
1.4數(shù)據(jù)分析
所有試驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3次，結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）中沃勒-鄧肯方法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用Origin 2021 Pro繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1嬰兒糞便中乳桿菌的初步分離篩選
在黑龍江省共采集到16份不同嬰兒糞便樣品，部分乳桿菌的光學(xué)顯微鏡形態(tài)見圖1。顯微鏡下觀察到菌體形態(tài)包括長桿、短桿、彎曲桿及鏈狀。
圖1部分乳桿菌形態(tài)
2.2產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的篩選
蛋白水解度實(shí)際上反映的是氨基酸利用與釋放之間的動態(tài)平衡，指標(biāo)并不能直接反映菌株的蛋白酶活性。本試驗(yàn)采用蛋白質(zhì)水解度結(jié)合脫脂乳平板法觀察透明圈直徑共同考察各菌株產(chǎn)蛋白酶情況。
2.2.1蛋白圈直徑和蛋白質(zhì)水解度分析
將分離純化得到的169株乳桿菌接種至12%滅菌脫脂乳發(fā)酵，凝乳結(jié)實(shí)的共72株，將72株乳桿菌放置脫脂乳固體平板中，以未接種并培養(yǎng)24 h后的脫脂乳樣品為對照，觀察其產(chǎn)生透明圈，并測定這些菌株的蛋白水解度。
乳桿菌生長于脫脂乳培養(yǎng)基中時能分解乳中蛋白質(zhì)生成游離氨基酸，不同菌株生成游離氨基酸的能力不同。由圖2可見，11株菌株均產(chǎn)生較為明顯的透明圈，透明圈直徑最大的是菌株T91和T95，均超過19 mm，但它們之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。蛋白質(zhì)水解度分析結(jié)果表明菌株T95的蛋白水解度在所有菌株中最高，可達(dá)到18.61±0.38 mmol/L，且顯著高于其他菌株（P＜0.05），其次是菌株N35、N38、T91和S29。所有試驗(yàn)菌株的蛋白水解能力均高于對照菌株LGG和LP_6110。本試驗(yàn)測定結(jié)果略高于張爽等測定69株菌株L-Leu的蛋白水解度，其測定范圍在1.89±0.14 mmol/L~11.60±0.52 mmol/L。
圖2產(chǎn)蛋白酶菌株蛋白水解度和水解圈直徑
2.2.2 RAPD圖譜
RAPD技術(shù)已經(jīng)在微生物基因型識別領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。為避免篩選出的菌株為同一菌株，以LGG和LP_6110作為對照，采用S23引物對上述試驗(yàn)得到的11株菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，剔除條帶和來源相同的菌株，最終挑選出8株性狀各不相同的乳桿菌，得到RAPD圖譜見圖3。由圖3可見，不同菌株之間的電泳圖有差異，菌株S21和P59比較相似，但來源于不同樣品，在光學(xué)顯微鏡下菌體形態(tài)差異較大，因此也將2株菌進(jìn)行了保留。
圖3 8株產(chǎn)蛋白酶菌株RAPD電泳
2.2.3菌株16S rDNA序列同源性分析
將得到的8株菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶明亮清晰且分子質(zhì)量皆在1 500 bp左右，符合測序要求。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（http://www.ncbi.nlm.nin.gov/BLAST）。序列比對結(jié)果見表1。所有菌均為鼠李糖乳酪桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。
表1 NCBI BLAST比對結(jié)果
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