2、結(jié)果與分析
2.1噬菌體的分離與形態(tài)學(xué)觀察
于2023年4月25日，從浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場(chǎng)下水道采集的水樣中分離純化得到一株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的烈性噬菌體，并將其命名為Yersinia phage Yen-yong1，簡(jiǎn)稱Yen-yong1(yong取自寧波的簡(jiǎn)稱“甬”的拼音)。
Yen-yong1在指示菌株CICC 10869的菌苔上形成透明、邊緣光滑且?guī)в袝炄Φ膱A形噬菌斑(圖1A)。Yen-yong1可在1.5 h內(nèi)將原本渾濁的CICC 10869培養(yǎng)液變?yōu)槌吻逋该鞯氖删w-菌裂解液(圖1B)，表明其對(duì)CICC 10869具有強(qiáng)烈的裂解活性。
▲圖1 Yersinia phage Yen-yong1的噬菌斑、菌裂解液、解聚酶驗(yàn)證與電鏡圖。A：Yersinia phage Yen-yong1在小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869菌苔上形成的噬菌斑；B：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869正常菌液(Control)與Yen-yong1裂解液(Test)；C：Yersinia phage Yen-yong1解聚酶驗(yàn)證結(jié)果；D-F：透射電子顯微鏡下的Yersinia phage Yen-yong1。
噬菌斑周圍的半透明暈圈被認(rèn)為是由噬菌體的解聚酶裂解宿主菌胞外聚合物所致。Yen-yong1的透明噬菌斑外圍存在明顯的半透明暈圈(圖1A)。根據(jù)1.2節(jié)所述方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Yen-yong1的基因組中可能含有解聚酶基因(圖1C)。
透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，Yen-yong1呈現(xiàn)長(zhǎng)尾病毒樣(Siphovirus-like)形態(tài)特征(圖1D-1F)。其頭部呈橢圓形，長(zhǎng)度為(83.32±0.15)nm，寬度為(59.57±2.28)nm；尾部長(zhǎng)度為(168.04±3.21)nm，寬度為(9.17±0.60)nm。
2.2噬菌體的基因組分析
Yen-yong1的全基因組序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為OR712444。其基因組平均測(cè)序深度為1 355.8×，長(zhǎng)度為51 321 bp，G+C含量為47.80%，共包含93個(gè)ORFs(編號(hào)為NMDCX0002088)，且未發(fā)現(xiàn)固定末端。經(jīng)tRNAscan-SE檢索，Yen-yong1基因組中未發(fā)現(xiàn)編碼tRNA的基因。
在Yen-yong1的93個(gè)ORFs中，有33個(gè)無法通過BLASTp注釋(即no hit)。進(jìn)一步使用在線注釋工具HHpred和HMMER進(jìn)行注釋、驗(yàn)證和校準(zhǔn)后，共有46個(gè)ORFs被注釋為已知功能蛋白，占總數(shù)的49.46%。其中，13個(gè)ORFs的Top BLAST hit(即BLASTp中相似度最高的序列)與噬菌體基因相關(guān)，僅有7個(gè)ORFs的Top BLAST hit來自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體基因，3個(gè)ORFs的Top BLAST hit來自大腸桿菌噬菌體基因(編號(hào)為NMDCX0002088)。這一結(jié)果提示腸桿菌科細(xì)菌噬菌體之間可能存在共進(jìn)化和基因水平轉(zhuǎn)移，也可能是因?yàn)樾∧c結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體分離和測(cè)序較少，導(dǎo)致參考序列不足。此外，14個(gè)ORFs的Top BLAST hit來自小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌基因，5個(gè)ORFs的Top BLAST hit來自耶爾森氏菌屬其他菌基因，表明該噬菌體與其宿主細(xì)菌之間可能存在基因交換。
Yen-yong1的基因組中未發(fā)現(xiàn)溶原相關(guān)基因。經(jīng)VFDB和CARD檢索，也未發(fā)現(xiàn)毒力因子和抗生素耐藥基因，這從基因組水平上表明其應(yīng)用的安全性。
ORF 13被注釋為編碼谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)。GST是一類廣泛存在于真核生物和原核生物中的酶，也是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的起始步驟。GST通過谷胱甘肽偶聯(lián)發(fā)揮抗氧化和解毒功能，保護(hù)生物體。此前未見有關(guān)噬菌體攜帶GST基因的報(bào)道。
Yen-yong1基因組被注釋的基因基于功能呈現(xiàn)有規(guī)律的模塊化分布(圖2)：5個(gè)ORFs被注釋為編碼溶菌相關(guān)蛋白(ORF 45、46、47、48、52)；3個(gè)ORFs被注釋為編碼參與噬菌體DNA包裝的蛋白(ORF 71、72、73)；20個(gè)ORFs被注釋為編碼參與DNA復(fù)制、調(diào)控與代謝的蛋白(ORF 8、9、11、12、16、17、19、20、21、22、30、31、32、33、36、42、43、44、60、78)；1個(gè)ORF被注釋為其他功能(ORF 13)；17個(gè)ORFs被注釋為編碼噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白(ORF 1、74、76、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93)。
▲圖2 Yersinia phage Yen-yong1的基因組圖譜
在噬菌體溶菌模塊中，ORF 45和46被注釋為編碼穿孔素(holin)，ORF 47被注釋為編碼內(nèi)溶素(endolysin)，ORF 48被注釋為編碼probable i-spanin subunit。在噬菌體裂解宿主的“三步模型”中，holin、endolysin和spanin分別完成由內(nèi)到外破壞細(xì)菌宿主的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的各步。Holin是一種控制宿主裂解的必不可少的小分子膜蛋白，可在細(xì)胞膜上形成跨膜孔，使內(nèi)溶素(即細(xì)菌溶解酶)能夠進(jìn)入細(xì)胞壁水解細(xì)菌的肽聚糖，而spanins可破壞宿主菌的外膜。在holin和endolysin完成內(nèi)膜滲透與肽聚糖降解后，spanins破壞細(xì)菌外膜，使宿主細(xì)胞裂解以釋放子代噬菌體。ORF 52編碼的蛋白含有溶菌酶樣結(jié)構(gòu)域(lysozyme like domain)，可能是一種溶菌酶。
盡管2.1節(jié)所述噬菌斑與解聚酶驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示Yen-yong1具有解聚酶活性，但本研究綜合運(yùn)用多種注釋工具，仍未從Yen-yong1的基因組中發(fā)現(xiàn)明確的解聚酶基因。通常情況下，對(duì)于序列新穎的噬菌體，由于參考序列較少，其基因組中能被生物信息學(xué)工具注釋的ORFs所占比例較低，大多不足60%。當(dāng)前公共數(shù)據(jù)庫中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體的參考序列相對(duì)較少，相關(guān)研究報(bào)道也較少。本研究綜合運(yùn)用多種生物信息學(xué)注釋工具，仍有50.54%的ORFs未能成功注釋，暫時(shí)也未能準(zhǔn)確注釋出其解聚酶基因。
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