2結(jié)果與分析
2.1菌株Q2對尖鐮孢菌SG－15生長發(fā)育的影響
顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)培養(yǎng)的SG－15菌絲生長正常，產(chǎn)生了較多的小型分生孢子，有些孢子已經(jīng)萌發(fā)；在菌株Q2與菌株SG－15共培養(yǎng)體系中SG－15菌絲形態(tài)發(fā)生顯著變化，菌絲細(xì)胞腫脹呈圓形，菌絲細(xì)胞間縊縮，菌絲細(xì)胞內(nèi)油球增多，菌絲內(nèi)出現(xiàn)紅色物質(zhì)，僅產(chǎn)生了較少的小型分生孢子，未見孢子萌發(fā)。在共培養(yǎng)試驗(yàn)中，菌株SG－15小型分生孢子在體系中的起始濃度約為2.0×106cfu／mL，在共培養(yǎng)5 d后，T1～T5共培養(yǎng)體系中的菌株SG－15小型分生孢子濃度顯著低于對照處理（CK）。CK處理中菌株SG－15的孢子濃度為1.20×108cfu／mL，T1、T2、T3、T4和T5處理分別為8.20×107、6.73×107、9.83×106、4.33×106cfu／mL和1.77×106cfu／mL。PI染色結(jié)果表明，與對照處理相比，共培養(yǎng)體系中熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說明PI染料可以透過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，菌株SG－15分生孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損。
2.2菌株Q2的轉(zhuǎn)錄組分析
在Control和FOM處理的6個轉(zhuǎn)錄組測序文庫中，獲得36 818萬條Reads，去除帶接頭、低質(zhì)量的Reads后，總共獲得超過34 397萬個高質(zhì)量的Reads。所有樣本的Q30值均大于92%。這些數(shù)據(jù)表明，RNA－seq獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量可用于進(jìn)一步的分析。在樣本Control的測序文庫中，97.76%的序列比對到菌株Q2的基因組中（NCBI登錄號：JABUIS000000000），每個樣本中超過98%的序列被唯一地定位到基因組上。在樣本FOM的測序文庫中，55.45%的序列比對到菌株Q2的基因組中，每個樣本中超過97%的序列被唯一地定位到基因組上。在菌株SG－15誘導(dǎo)下，菌株Q2的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，共有2 664個差異表達(dá)基因，占總基因的28.14%，其中1 302個基因上調(diào)、1 362個基因下調(diào)。
通過GO（gene ontology）分析和KEGG代謝通路分析對差異基因在注釋功能中的分布狀況進(jìn)行了分析。GO分析將基因劃分為分子功能（molecular functions）、生物過程（biological processes）和細(xì)胞成分（cellular components）。在分子功能分類中，差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集于氧化還原酶活性（oxidoreductase activity，238個基因上調(diào)、218個基因下調(diào)）和催化活性（monooxygenase activity，34個基因上調(diào)、59個基因下調(diào)）。在生物過程類別中，差異表達(dá)基因主要富集于氧化還原過程（oxidation－reduction process，2 155個基因上調(diào)、220個基因下調(diào)）和跨膜運(yùn)輸（transmembrane transport，161個基因上調(diào)、127個基因下調(diào)）。在細(xì)胞成分類別中，差異表達(dá)基因主要富集于膜固有組分（intrinsic component of membrane，164個基因上調(diào)、159個基因下調(diào)）、膜部分（membrane part，187個基因上調(diào)、162個基因下調(diào)）和膜整體組分（integral component of membrane，161個基因上調(diào)、152個基因下調(diào)）。由GO分析可知，菌株Q2氧化還原過程及氧化還原酶活性和催化活性較為活躍。
DEGs被注釋到111條代謝通路中，共獲得顯著富集代謝通路27條，主要為酪氨酸代謝（tyrosine metabolism，17個基因上調(diào)、8個基因下調(diào)）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，35個基因上調(diào)、1個基因下調(diào)）、戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions，14個基因上調(diào)、2個基因下調(diào)）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism，11個基因上調(diào)、7個基因下調(diào)）、糖酵解／糖異生（glycolysis／gluconeogenesis，20個基因上調(diào)、3個基因下調(diào)）、檸檬酸循環(huán)（citrate cycle，13個基因上調(diào)、1個基因下調(diào)）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism，9個基因上調(diào)、7個基因下調(diào)）。這些結(jié)果表明，在尖鐮孢菌SG－15誘導(dǎo)下，菌株Q2具有更加活躍的營養(yǎng)物質(zhì)代謝和能量代謝。
2.3尖鐮孢菌誘導(dǎo)下菌株Q2幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶相關(guān)基因表達(dá)
菌株Q2基因組中共計(jì)預(yù)測和注釋到9 600個編碼基因，其中在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）中注釋到463個碳水化合物活性酶基因，占總基因數(shù)的4.8%，包括200個糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、83個糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases，GTs）、2個多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、84個碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、79個輔助活性酶（auxiliary activities，AAs）和15個碳水化合物結(jié)合酶（carbohydrate-binding modules，CBM）。在糖苷水解酶的基因中注釋到30個葡聚糖酶（glucanase）基因和23個幾丁質(zhì)酶（chitinase）基因。結(jié)合菌株Q2基因組在SwissProt數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，篩選到了16個葡聚糖酶基因和13個幾丁質(zhì)酶基因。為研究菌株Q2與尖鐮孢菌菌株SG－15互作過程中葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因表達(dá)差異，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值作為基因的相對表達(dá)量構(gòu)建了基因表達(dá)熱圖。在菌株SG－15誘導(dǎo)下，菌株Q2的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶相關(guān)基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢，其中β－1，3－葡聚糖酶基因（TP1．g228、TP2．g877）和幾丁質(zhì)酶（TP1．g938、TP4．g281、TP4．g285、TP5．g130、TP5．g819）的表達(dá)水平上升。在菌株Q2和菌株SG－15共培養(yǎng)體系中，β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性分別為3.40 U／mL和1.97 U／mL，相比于菌株Q2純培養(yǎng)體系中的β－1，3－葡聚糖酶活性（2.51 U／mL）和幾丁質(zhì)酶活性（1.79 U／mL）提高了35.46%和10.06%。
2.4尖鐮孢菌SG－15誘導(dǎo)下菌株Q2的次級代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的表達(dá)
基于antiSMASH數(shù)據(jù)庫，在Q2基因組中預(yù)測到57個次級代謝物簇、66個核心生物合成基因（core biosynthetic genes），主要包括Ⅰ型聚酮合酶（T1PKS）、非核糖體肽合成酶（NRPS）、β－內(nèi)酰胺（beta-lactone）、吲哚類（indole）、多萜（terpene）、真菌核糖體合成的和翻譯后修飾的肽（fungal-RiPP）。根據(jù)FPKM值構(gòu)建的基因表達(dá)熱圖顯示，在菌株SG－15誘導(dǎo)下，菌株Q2的次級代謝產(chǎn)物相關(guān)基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢，其中TP1．g1012（pentalenene synthase）、TP7．g18（terpene synthase）、TP8．g157（trichodiene synthase）、TP8．g275（polyketide synthase）、TP11．g64（nonribosomal peptide synthetase）和TP17．g126（polyketide synthase）等基因的表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05）。進(jìn)一步對以TP17．g126為核心生物合成基因的次級代謝產(chǎn)物簇相關(guān)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，以TP17.g126為核心的次級代謝產(chǎn)物簇包括13個基因，其中8個基因的表達(dá)水平在SG－15菌株誘導(dǎo)下顯著提升，經(jīng)qRT－PCR驗(yàn)證表明，TP17－124、TP17－125、TP17－126、TP17－127、TP17－128、TP17－129、TP17－130和TP17－131分別提高9.12、8.68、96.68、30.67、31.88、4.53、22.74、8.41倍。但尚未明確TP17．g126基因參與合成的次級代謝產(chǎn)物對SG－15菌株生長的影響。
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