摘要
目的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)是耶爾森氏菌病(yersiniosis)的主要致病因子，是全球最重要的食源性致病菌之一。本研究的目的在于分離、鑒定其烈性噬菌體，并探討噬菌體的應(yīng)用潛力。
方法以Yersinia enterocolitica CICC 10869為指示宿主，采用雙層瓊脂平板法從浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場下水道中分離得到一株烈性噬菌體Yersinia phage Yen-yong1(簡稱Yen-yong1)，對其進行形態(tài)學(xué)觀察、宿主范圍測定、全基因組測序、基因功能注釋、系統(tǒng)進化地位分析、理化耐受性測定以及生物被膜去除能力測定，并檢測其對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除作用。
結(jié)果Yen-yong1可在1.5 h內(nèi)使菌液裂解澄清。透射電鏡下，Yen-yong1呈長尾病毒樣(Siphovirus-like)，橢圓形頭部長(83.32±0.15)nm、寬(59.57±2.28)nm；尾長(168.04±3.21)nm。Yen-yong1的dsDNA基因組全長51 321 bp，G+C含量為47.80%，包含93個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)，且不含影響應(yīng)用的溶原、耐藥或毒力因子基因。Yen-yong1與公共數(shù)據(jù)庫中的其他噬菌體基因組間的最高核苷酸序列相似度低至20.64%，遠低于屬界限值(70.00%)；與其他噬菌體間共享的核心基因(core gene)占比最高值僅為20.00%，小于亞科閾值(27.00%-79.00%)。Yen-yong1在有尾綱(Caudoviricetes)中代表一個新的屬和亞科。Yen-yong1具有種特異性，僅裂解小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，在4株供試小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株中可裂解3株。Yen-yong1在-80-60℃、pH 2.0-13.0、0-3%氯化鈉的脅迫下均保持高水平的溶菌活性。此外，Yen-yong1能夠破壞細菌生物被膜。在25℃下，當噬菌體與宿主的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為100時，Yen-yong1對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202株的清除率分別為93.48%、52.77%和43.24%；在4℃下，3株供試菌株均可增殖，而在MOI為100時，Yen-yong1對生豬肉片中CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202株的清除率分別為98.28%、78.35%和96.33%。
結(jié)論Yen-yong1代表一個以往未知的進化譜系，其具有優(yōu)良的生物學(xué)特性以及在常溫和低溫下良好的保鮮潛力。本研究拓寬了對噬菌體的認知，豐富了噬菌體庫和基因庫，為食源性耶爾森氏菌病的防控奠定了基礎(chǔ)。
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)是一種革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的耶爾森氏菌屬(Yersinia)，首次發(fā)現(xiàn)和命名于20世紀中葉。耶爾森氏菌屬由28個種組成，其中鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌對人類具有致病性。
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分布廣泛，是少數(shù)幾種能在冷藏溫度下生長的腸道致病菌之一，是全球范圍內(nèi)重要的食源性致病菌之一。它在肉類、奶制品、糕餅、蔬菜沙拉、水產(chǎn)品、飲用水、食品加工工人和屠宰場工人中均有檢出。除了引起惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱和腹痛等癥狀外，它還可能引發(fā)回腸炎、闌尾炎、膽囊炎、腸系膜淋巴結(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、腦膜炎、腱鞘炎、小腸梗阻和各種膿腫，甚至可能引發(fā)菌血癥和敗血癥，導(dǎo)致死亡。相關(guān)病例主要與食用受污染的生豬肉有關(guān)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌對不利條件具有很強的適應(yīng)性，其顯著特征之一是具有較強的耐冷能力(0-4℃)，并且能夠在pH 4.2-9.0和高鹽環(huán)境(7%)中存活。其抗藥性和生物被膜特性進一步增加了源頭控制的難度。
噬菌體(bacteriophages，簡稱phages)是特異性靶向感染細菌的病毒，近年來成為研究熱點。2023年10月，歐盟頒布了獸用噬菌體產(chǎn)品指南Guideline on Quality,Safety and Efficacy of Veterinary Medicinal Products Specifically Designed for Phage Therapy；2024年，歐洲藥品質(zhì)量管理局(European directorate for the quality of medicines&healthcare,EDQM)正式通過“關(guān)于噬菌體治療藥用產(chǎn)品”的新版總章，將噬菌體增列入European Pharmacopoeia。我國噬菌體研究聯(lián)盟、中國微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)專業(yè)委員會和中國生物工程學(xué)會噬菌體技術(shù)專委會也發(fā)布了預(yù)防及治療用噬菌體質(zhì)量標準專家共識。近年來，噬菌體的應(yīng)用案例不斷增加。
噬菌體不會影響食品的營養(yǎng)和感官特性，也不會產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)而對人體健康造成影響。作為一種綠色環(huán)保、高效安全、特異性高的天然友好型生物控制劑，噬菌體被認為是處理食品生產(chǎn)鏈病原菌污染的理想選擇。近年來，噬菌體在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究得到了各國政策的支持和鼓勵，一系列產(chǎn)品已經(jīng)進入市場。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)已批準噬菌體用作“食品添加劑”，并授予“公認安全”(generally recognized as safe,GRAS)稱號。2006年，F(xiàn)DA批準了荷蘭Micreos食品安全公司的李斯特菌噬菌體生物控制產(chǎn)品Listex?P100應(yīng)用于即食肉類和家禽產(chǎn)品，隨后針對沙門氏菌、產(chǎn)毒大腸桿菌和腸球菌等食源性致病菌的噬菌體制劑也相繼獲得FDA的GRAS認證，被批準應(yīng)用于食品，例如Intralytix公司的沙門氏菌噬菌體產(chǎn)品SalmoFresh?、Phagelux公司的沙門氏菌噬菌體產(chǎn)品、青島諾安百特生物技術(shù)有限公司的沙門氏菌噬菌體產(chǎn)品和Micreos食品安全公司的大腸桿菌噬菌體產(chǎn)品PhageGuard E?等。食品行業(yè)噬菌體生物制劑的研發(fā)主要集中在對沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和單核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的控制。截至目前，尚未有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體獲得GRAS認證。
本研究以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)CICC 10869(簡稱CICC 10869)為指示菌株，從浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場下水道采集的表層水樣中分離純化了一株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌烈性噬菌體Yersinia phage Yen-yong1(簡稱Yen-yong1)。對其進行了形態(tài)學(xué)觀察、基因組序列測定、基因注釋、基于全基因組比對的系統(tǒng)進化地位分析、宿主范圍分析、增殖特性分析、理化特性分析；檢測了其對細菌生物被膜的去除能力；并檢測了其在25℃和4℃下對豬肉中污染的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除能力。
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