1.2實驗方法
1.2.1甜櫻桃流膠病原菌的鑒定用無菌解剖刀刮取0.1～0.2 g已在PDA培養(yǎng)基28℃暗培養(yǎng)活化的病原真菌SXYTLJ01的菌絲于1.5 mL離心管中,按SK8259(真菌)試劑盒操作提取基因組DNA,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yīng)用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和EF-1α-NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)、EF-1α-NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′),以分離得到的病原菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。25μL PCR反應(yīng)體系:94℃預(yù)變性4 min,94℃45 s,55℃45 s,72℃1 min,共30個循環(huán),72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在全能成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)有限公司測序。靶基因序列進(jìn)行BLAST比對,MEGA6.0程序處理,NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析病原菌的親緣關(guān)系,以確定其分類學(xué)地位。
1.2.2菌絲結(jié)構(gòu)的觀察
利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行菌絲結(jié)構(gòu)觀察:在回接有病原真菌SXYTLJ01的PDA上進(jìn)行45°插片、28℃暗培養(yǎng),培養(yǎng)3～7 d后用乳酸石炭酚棉藍(lán)進(jìn)行染色,鏡檢,觀察該菌的菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)。
1.2.3誘導(dǎo)產(chǎn)孢及孢子形態(tài)的觀察
采用碳氮源缺乏、菌落劃傷、近紫外線照射的方式誘導(dǎo)產(chǎn)孢。每組處理至少重復(fù)3次。
碳氮源缺乏:將活化后長勢良好的菌株分別接種于不加碳源(葡萄糖)的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和不加氮源(蛋白胨)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,28℃暗培養(yǎng)3～7 d,用乳酸石炭酚棉蘭染色,鏡檢,觀察產(chǎn)孢情況。
菌落劃傷:將活化后長勢良好的菌株接種于PDA培養(yǎng)基,28℃暗培養(yǎng)2～3 d,用無菌刀片沿培養(yǎng)基中部將菌落劃至見皿底,再培養(yǎng)1～3 d,在傷口邊緣取樣,染色液染色,鏡檢,觀察產(chǎn)孢情況。
近紫外線照射:將活化后長勢良好的菌株接種于PDA培養(yǎng)基,12 h近紫外線(18 W,直徑19 mm波長253.7 nm,距離培養(yǎng)基50 cm)照射后28℃暗培養(yǎng)2～3 d,鏡檢,觀察產(chǎn)孢情況。
1.2.4最適生長條件利用平板測定法
研究葡萄座腔菌的最適生長條件:將活化后長勢良好的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中央,采用十字交叉法每天定時測定菌落直徑。分別將溫度、光照、pH、碳源、氮源這些因素作為單因素試驗條件,探究不同條件下菌株的生長狀況。每個處理至少重復(fù)3次,取其平均值。
溫度的影響:將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中央,以15、20、25、28、30、35、40℃七個溫度作為試驗溫度梯度,暗培養(yǎng),每24 h測量一次菌落直徑。
光照的影響:將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中央,分別進(jìn)行全光照、全黑暗、12 h光照/12 h黑暗交替三種培養(yǎng)處理,28℃培養(yǎng),每24 h測量一次菌落直徑。
pH的影響:將菌株分別接種于pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培養(yǎng)基中央,28℃暗培養(yǎng),每24 h測量一次菌落直徑。
碳源的影響:將菌株接種于不含碳源和碳源分別為蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、葡萄糖的PDA培養(yǎng)基中央,28℃暗培養(yǎng),每24 h測量一次菌落直徑。
氮源的影響:將菌株接種于不含氮源和氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉的PDA培養(yǎng)基中央,28℃暗培養(yǎng),每24 h測量一次菌落直徑。
1.2.5致病菌致死溫度區(qū)間的確定
將活化后長滿平板的菌落通過牛津杯取成直徑約0.8 cm的菌餅,接取菌餅于5 mL PDB(馬鈴薯-葡萄糖肉湯培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中,分別將試管放在35、40、45、50、55、60℃的恒溫水浴鍋中水浴20 min,對照組不水浴。水浴完成后將上述試管置于28℃搖速為180 r/min振蕩箱中暗培養(yǎng)72 h,觀察菌絲生長情況。
將上述震蕩培養(yǎng)的菌液進(jìn)行平板回接驗證。具體步驟:長出菌絲球的,分別用鑷子鉗取大小相同的菌絲塊于PDA培養(yǎng)基;菌餅未生長的,分別用鑷子從菌餅上鉗取同等大小的菌塊于PDA培養(yǎng)基。28℃暗培養(yǎng),連續(xù)觀察3～7 d,看是否生長。如果菌株在PDB培養(yǎng)液中經(jīng)某一溫度區(qū)間水浴后振蕩培養(yǎng)不生長,且回接PDA培養(yǎng)基也不生長,則將此溫度區(qū)間確定為菌株SXYTLJ01的致死溫度區(qū)間。
1.3數(shù)據(jù)處理
每組處理重復(fù)三次,取平均值;用Origin 8.0制圖;用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對差異顯著性進(jìn)行分析,P<0.05為顯著水平,P<0.01為極顯著水平;用MEGA6.0軟件以NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
相關(guān)新聞推薦
1、生物炭與細(xì)菌微生物互作對小白菜生長的影響及益生菌的分離表征
2、針對內(nèi)毒素及微生物，分享醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系構(gòu)建及環(huán)節(jié)管控重點
3、不同碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長速度的影響（二）