1.10 SLM對PEDV復(fù)制周期的影響


1.10.1 SLM對病毒粒子的作用將Vero細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長到90%后，將以下四管溶液(A:0.2 MOI PEDV和5μmol·L-1SLM混合液，B:0.2 MOI PEDV稀釋液，C:維持液，D:5μmol·L-1SLM稀釋液)各設(shè)置兩組，分別放置在培養(yǎng)箱中作用3 h和5 h，將以上溶液接種于Vero細(xì)胞，然后置于37℃孵育1 h，用PBS洗滌細(xì)胞，再加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后收集病毒液，提取核酸，RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的高低，判斷SLM是否對PEDV病毒粒子具有直接滅活作用。


1.10.2 SLM對病毒吸附的影響將Vero細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長到90%后，用含有0或5μmol·L-1SLM的維持液在37℃預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用含有0.2 MOI PEDV和相應(yīng)SLM濃度的混合液在4℃處理細(xì)胞15、30和60 min，再用冰冷的PBS洗滌后收集細(xì)胞，提取核酸，使用RT-qPCR檢測細(xì)胞中PEDVN基因的mRNA水平。通過比較同一時(shí)間段SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低，判斷SLM是否影響病毒的吸附。


1.10.3 SLM對病毒入胞的影響將Vero細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長到90%后，首先將細(xì)胞板放入4℃預(yù)冷，然后用0.2 MOI PEDV在4℃感染細(xì)胞2 h，再更換含有0或5μmol·L-1SLM的維持液，37℃繼續(xù)孵育0.5、1和2 h，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，以去除未入胞的病毒，最后收集細(xì)胞，提取核酸，使用RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低，判斷SLM是否影響PEDV的入胞。


1.10.4 SLM對病毒復(fù)制的影響將Vero細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長到90%后，將細(xì)胞上清液更換為含有0.2 MOI PEDV的維持液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，用PBS洗滌細(xì)胞后補(bǔ)充維持液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接毒后4 h將培養(yǎng)基更換為含有0或5μmol·L-1SLM的維持液，置于37℃繼續(xù)孵育2、4和6 h，然后用PBS洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞后提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低，判斷SLM是否影響病毒的復(fù)制。


1.10.5 SLM對病毒釋放的影響將Vero細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長到90%后，用0.2 MOI PEDV在37℃感染細(xì)胞1 h，然后更換為維持液繼續(xù)培養(yǎng)10 h，再將培養(yǎng)基更換為含有0或5μmol·L-1SLM的維持液繼續(xù)孵育0.5、1和2 h后收集樣品，提取核酸，RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低，判斷SLM是否影響PEDV的釋放。


1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析


所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用單因素方差分析(ANOVA)檢查組間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。圖中星號表示有顯著差異(*.P<0.05表示差異顯著;**.P<0.01表示差異非常顯著;***.P<0.001表示差異極顯著;ns代表差異不顯著)。


2結(jié)果


2.1 PEDV的TCID50及其在Vero細(xì)胞上的生長曲線


用Reed-Muench兩式法測定PEDV感染Vero細(xì)胞不同時(shí)間的TCID50，繪制病毒生長曲線，結(jié)果如圖1所示，PEDV感染細(xì)胞后24 h病毒滴度最高，約107.7·0.1 mL-1，隨后病毒滴度緩慢下降，感染后60 h的TCID50約107.2·0.1 mL-1。

圖1 PEDV在Vero細(xì)胞上的生長曲線


2.2 CC50和IC50


為了確定后期試驗(yàn)所使用的SLM濃度，首先使用CCK-8試劑盒測定不同SLM濃度下的細(xì)胞活力，結(jié)果表明SLM的CC50為7.698μmol·L-1(圖2A);經(jīng)統(tǒng)計(jì)不同濃度SLM處理組的CPE，結(jié)果表明SLM對PEDV的IC50為1.617μmol·L-1(圖2B)。同時(shí)，經(jīng)CCK-8試劑盒測定所用SLM濃度(0.05、0.5、5μmol·L-1)處理后的細(xì)胞活力，結(jié)果如圖2C所示，以上濃度的SLM對Vero細(xì)胞活力無影響。

A.CC50的測定;B.IC50的測定;C.SLM對Vero細(xì)胞活力的影響

圖2 SLM對Vero和PEDV的影響



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