2.5地衣芽孢桿菌的抑菌特性研究
2.5.1與致病菌混合培養(yǎng)
由表5可知，地衣芽孢桿菌C30-2對金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌具有較強(qiáng)的殺滅作用。經(jīng)24h培養(yǎng)后金黃色葡萄球菌活菌數(shù)為0，傷寒沙門氏菌的活菌數(shù)在共同培養(yǎng)后下降到4.60×103 CFU/mL。
表5混合培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
2.5.2抑菌試驗(yàn)
地衣芽孢桿菌C30-2的發(fā)酵上清液抑菌譜較廣,不僅對金黃色葡萄球菌、植物乳桿菌和魏氏梭菌等革蘭氏陽性菌具有抑制作用,同時(shí)對傷寒沙門氏菌、糞腸球菌和梅氏弧菌等革蘭氏陰性細(xì)菌也具有明顯的抑制作用(表6和圖5)。
圖5地衣芽孢桿菌發(fā)酵液上清對抑菌圈直徑的影響
表6地衣芽孢桿菌發(fā)酵液上清對常見致病菌抑菌結(jié)果
注:抑菌能力根據(jù)發(fā)酵上清液抑菌圈直徑判定;+表示抑菌圈直徑<10mm，++表示抑菌圈直徑10~15mm，+++表示抑菌圈直徑>15mm，-表示無抑菌作用。
3討論
地衣芽孢桿菌廣泛分布于自然界，可產(chǎn)生多種活性有益代謝物，能調(diào)整并治療菌群失調(diào)，還具有改善動(dòng)物免疫系統(tǒng)的功能，使機(jī)體腸道免疫保持較高水平，是良好的免疫激動(dòng)劑。本研究以環(huán)境土壤為篩選載體，初步分離出備選菌株，并經(jīng)過嚴(yán)格篩選，確保了菌株的來源天然和健康。
飼料生產(chǎn)過程中調(diào)質(zhì)和制粒等程序的溫度和壓力是制約微生態(tài)制劑中活菌數(shù)量的重要因素，也是影響活菌制劑質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，活菌在被動(dòng)物采食后還要經(jīng)過動(dòng)物消化道中消化液消化才能抵達(dá)腸道，進(jìn)而發(fā)揮益生作用。因此，本研究在篩選過程中同時(shí)兼顧了耐酸與耐膽鹽2個(gè)指標(biāo)，結(jié)合溫度耐受性試驗(yàn)，使篩選出的目標(biāo)菌株不僅能耐受飼料加工過程中的惡劣環(huán)境，而且對胃酸和膽鹽等消化道環(huán)境具有較高的耐受性。一般仔豬飼料的制粒溫度為70~85℃，高溫處理后存活率低是菌種作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。
從耐熱存活率看，C30-2在85℃處理10 min后存活率仍達(dá)93.33%，處理15min后存活率達(dá)24%，表明地衣芽孢桿菌C30-2耐熱性能較好，在飼料制粒加工過程中損失較少。同時(shí)，地衣芽孢桿菌C30-2在pH為3.0及2.5時(shí)活性均影響較小，且在膽鹽濃度0.3%、1%、2%下培養(yǎng)3h均出現(xiàn)輕微生長，因此C30-2若作為飼用益生菌進(jìn)入動(dòng)物消化道后能經(jīng)受酸性環(huán)境和膽鹽的刺激，能夠成功達(dá)到腸道發(fā)揮其益生功能。益生菌能夠快速生長和增殖是其在動(dòng)物消化道內(nèi)發(fā)揮作用的重要前提和保障。地衣芽孢桿菌雖然不能長期定植于消化道內(nèi)，但是卻也能在消化道內(nèi)保留一段時(shí)間，因此更快速的繁殖能力是基礎(chǔ)。在本試驗(yàn)中，觀察到地衣芽孢桿菌C30-2在培養(yǎng)5h之后就進(jìn)入了對數(shù)生長期，通常乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間在20h左右，其他研究報(bào)道的地衣芽孢桿菌也在12h左右，這說明本研究篩選得到的地衣芽孢桿菌C30-2有較快的生長速率。
金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌和大腸桿菌是極為常見的條件性致病菌，也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因。本試驗(yàn)中篩選獲得的地衣芽孢桿菌C30-2即對金黃色葡萄球菌抑制能力明顯增強(qiáng);進(jìn)一步研究證實(shí)了該菌株對金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌具有良好的抑制效果,并能夠抑制植物乳桿菌、魏氏梭菌和糞腸球菌、梅氏弧菌等細(xì)菌生長。這說明該株地衣芽孢桿菌能分泌高效的抑菌活性物質(zhì),具備抗腹瀉的益生潛力。已有研究表明，芽孢桿菌對斷奶仔豬具有保護(hù)作用，同時(shí)具有改善腸道健康和提高生長性能的作用。
研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.75%芽孢桿菌制劑能提高斷奶仔豬腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，增加盲腸短鏈脂肪酸(SCFA)水平，促進(jìn)仔豬健康生長。經(jīng)大腸桿菌K88處理后的斷奶仔豬,飼喂枯草芽孢桿菌后增加了其血清中IgA和IgG濃度，減弱了大腸桿菌引起的免疫反應(yīng)，提高了平均日增重。仔豬腹瀉主要原因是由于仔豬面臨外界應(yīng)激下導(dǎo)致的腸道屏障功能發(fā)生紊亂，出現(xiàn)腸黏膜受損、免疫系統(tǒng)失調(diào)等問題。Hung等發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌發(fā)酵制品可顯著降低斷奶仔豬腹瀉發(fā)生率，并改善其糞便微生物區(qū)系組成?；潞Ａ盏仍谧胸i飼糧中添加地衣芽孢桿菌后，提高了脂多糖(LPS)應(yīng)激下仔豬的腸黏膜抗氧化能力和免疫力，并促進(jìn)腸道形態(tài)的修復(fù)，可減緩LPS應(yīng)激導(dǎo)致的腸道損傷。另外，地衣芽孢桿菌也有提高斷奶仔豬飼料轉(zhuǎn)化效率和降低腹瀉率的趨勢，并能夠增加回腸的絨毛高度和結(jié)腸的隱窩深度，增加回腸和結(jié)腸中芽孢桿菌屬(Bacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的豐度，還能提高結(jié)腸食糜中乙酸的含量，進(jìn)一步說明地衣芽孢桿菌對于斷奶仔豬具有益生作用。這些結(jié)果都證實(shí)了地衣芽孢桿菌具有良好的益生性能，開發(fā)不同來源的地衣芽孢桿菌具有較大的發(fā)展空間和應(yīng)用價(jià)值。
4結(jié)論
本研究以土壤為材料，分離并篩選出1株對金黃色葡萄球菌具有明顯抑制能力的地衣芽孢桿菌，并發(fā)現(xiàn)其在耐高溫、耐膽鹽和耐酸等方面具有較大優(yōu)勢，且抑菌效果優(yōu)良，是1株可用于微生態(tài)制劑生產(chǎn)的優(yōu)勢菌種。
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