研究簡介
本論文主要對醫(yī)院病原體嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）進行了研究，通過系統(tǒng)突變分析揭示了其組氨酸激酶基因在生物膜發(fā)育中的關(guān)鍵作用，特別是BfmAK系統(tǒng)對生物膜形成的調(diào)控機制。嗜麥芽窄食單胞菌是一種革蘭氏陰性細菌，因其強大的生物膜形成能力和對多種抗生素的耐藥性，成為醫(yī)院中對免疫系統(tǒng)受損患者構(gòu)成嚴重威脅的病原體。本研究在S.maltophilia基因組中注釋了62個潛在的組氨酸激酶基因，并成功構(gòu)建了51個突變體。通過表型特征分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列在細菌生長、游動性和生物膜發(fā)育方面存在缺陷的突變體。其中，BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208）雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（TCS）被證實對生物膜形成具有關(guān)鍵調(diào)控作用。研究人員進一步通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗和電泳遷移率變化分析（EMSA）實驗，揭示了BfmA作為轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合bfmA-bfmK操縱子和acoT基因的啟動子區(qū)域，并正向調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。acoT基因編碼一種?；o酶A硫酯酶，與生物膜發(fā)育密切相關(guān)。實驗結(jié)果表明，acoT基因的缺失顯著降低了生物膜的形成能力，而acoT基因的過表達可以部分恢復(fù)bfmA突變體的生物膜形成缺陷。本研究不僅為理解S.maltophilia的生物膜形成機制提供了重要的遺傳信息，而且為開發(fā)針對這種細菌的新療法或抗菌劑提供了潛在的分子靶點。通過深入了解BfmAK系統(tǒng)的功能和調(diào)控機制，未來的研究可以探索新的策略來對抗這種在醫(yī)院環(huán)境中對患者構(gòu)成嚴重威脅的病原體。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C自動化微生物生長曲線分析系統(tǒng)用于測量嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其突變體在NYG培養(yǎng)基中的生長情況。使用NYG培養(yǎng)基（5 g/L胰蛋白胨，3 g/L酵母提取物，20 g/L甘油，pH 7.0）。將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌野生型菌株和各個突變體菌株從-80°C保存的甘油菌中復(fù)蘇，接種到NYG培養(yǎng)基中，28°C預(yù)培養(yǎng)過夜。將預(yù)培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種到新鮮的NYG培養(yǎng)基中，使初始OD600值約為0.1。將Bioscreen C儀器預(yù)熱至28°C，確保恒溫條件。在Bioscreen C軟件中設(shè)置測量參數(shù)，包括測量間隔時間（通常為15分鐘）和測量時長為24小時。通過Bioscreen測試的生長曲線，研究人員發(fā)現(xiàn)某些突變體（如Smlt0882和Smlt1636）的生長速率顯著低于野生型菌株，表明這些基因?qū)毦纳L有重要影響。研究人員通過Bioscreen C測量的生長曲線數(shù)據(jù)，評估生物膜形成能力，排除了生長速率差異對結(jié)果的干擾，確保生物膜形成能力的差異是由特定基因的功能引起的，而非生長速率的差異。
實驗結(jié)果
在51個突變體中，研究人員發(fā)現(xiàn)9個突變體的生物膜形成能力顯著下降，包括Smlt2324（ravS）和Smlt2234（rpfC）等。通過構(gòu)建bfmA和bfmK的插入突變體和互補株，研究人員證實了BfmAK系統(tǒng)對生物膜形成的調(diào)控作用。BfmK具有自激酶活性，而BfmA作為轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控bfmA-bfmK操縱子和acoT基因的轉(zhuǎn)錄。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，研究人員篩選出六個可能被BfmA結(jié)合的啟動子區(qū)域。BfmAK系統(tǒng)是S.maltophilia中控制生物膜形成的TCS，BfmK具有自激酶活性，而BfmA作為轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控bfmA-bfmK操縱子和acoT基因的轉(zhuǎn)錄。BfmA不僅自調(diào)控其自身的表達，還通過調(diào)控acoT基因的表達參與生物膜的形成。acoT基因的缺失顯著降低了生物膜的形成能力，而acoT基因的過表達可以部分恢復(fù)bfmA突變體的生物膜形成缺陷。為開發(fā)針對S.maltophilia的新療法或抗菌劑提供了潛在的分子靶點。通過深入了解BfmAK系統(tǒng)的功能和調(diào)控機制，未來的研究可以探索新的策略來對抗這種在醫(yī)院環(huán)境中對患者構(gòu)成嚴重威脅的病原體。
圖1、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ATCC 13637組氨酸激酶編碼基因插入突變體的菌落形態(tài)及游動能力。(A)突變體在平板上的位置分布。列與行的順序分別以數(shù)字和字母標(biāo)示。(B)細菌菌株在NYG富營養(yǎng)平板(1.5%瓊脂)上培養(yǎng)24小時(28℃)的形態(tài)特征。每株菌接種1微升培養(yǎng)物于平板。(C)細菌菌株在含0.1%瓊脂的半固體NYG平板上的游動能力。采用牙簽穿刺接種后，28℃培養(yǎng)12小時。
圖2、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ATCC 13637組氨酸激酶基因突變體的生物膜發(fā)育情況。(A)各菌株生物膜水平的定量分析。采用結(jié)晶紫染色法對生物膜進行定量檢測。(B)菌株生長曲線。生物膜定量前，使用96孔板測定細菌培養(yǎng)物在600 nm波長下的吸光度值(OD600)。(C)生物膜量與細菌生長(OD600)的比值。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)。*表示與野生型菌株相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.05，采用Student's t檢驗計算)。
圖3、Smlt4208-Smlt4209基因座的操縱子結(jié)構(gòu)及其在生物膜發(fā)育中的作用。(A)Smlt4204-Smlt 4209基因座的基因組定位。箭頭表示基因及其轉(zhuǎn)錄方向，標(biāo)注了基因名稱，箭頭周圍標(biāo)示了用于RT-PCR的引物(P1至P12)。(B)通過RT-PCR解析Smlt4204-Smlt4209基因座的操縱子結(jié)構(gòu)。使用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ATCC 13637在NYG培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)的總RNA，以隨機引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT表示以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增；DNA表示以細菌總DNA為模板的陽性對照；-RT表示cDNA合成時未加入逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照。(C)BfmA-BfmK系統(tǒng)的體外磷酸化分析。使用50μg BfmK反向膜囊泡和20μM可溶性BfmA蛋白。[γ-32P]ATP按所示時間加入反應(yīng)體系，反應(yīng)通過SDS上樣緩沖液終止，樣品經(jīng)12%SDS-PAGE分離。Int.表示通過Quantity One軟件估算的條帶強度。(D)bfmK(Smlt4208)和bfmA(Smlt4209)調(diào)控嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ATCC 13637的生物膜形成。采用結(jié)晶紫染色法通過OD590測定細菌生物膜量。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)。*表示P<0.01(Student's t檢驗)。WT：野生型菌株；IFD-bfmK和IFD-bfmA：bfmK和bfmA的框內(nèi)缺失突變體；IFD-bfmK-bfmK和IFD-bfmA-bfmA：互補菌株。所有菌株(包括野生型)均含有相應(yīng)的空白或重組pBBRMCS2載體。(E)各菌株在NYG富營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長曲線。
圖4、BfmA調(diào)控自身操縱子及Smlt0800的轉(zhuǎn)錄。(A)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)篩選BfmA結(jié)合序列。各菌株在NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.4，通過ChIP收集BfmA結(jié)合的雙鏈DNA。采用半定量PCR定量與BfmA共沉淀的DNA量。No：未標(biāo)記菌株(IFD-bfmA-bfmA)的ChIP DNA樣本；His6：His6標(biāo)記菌株(IFD-bfmA-bfmA*)的ChIP DNA樣本；Sample：使用ChIP DNA進行PCR擴增；Input：使用ChIP前從細胞裂解液提取的細菌DNA進行PCR擴增，作為上樣對照。(B)候選基因轉(zhuǎn)錄水平的半定量RT-PCR分析。以嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ATCC 13637總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。-RT表示陰性對照，cDNA合成時未加入逆轉(zhuǎn)錄酶。所有測試菌株均含有pBBRMCS2載體以保證可比性。實驗獨立重復(fù)三次。(C)實時定量PCR檢測BfmA調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。以tmRNA擴增的cDNA作為內(nèi)參。每次檢測均設(shè)置生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。圖示為一次代表性實驗結(jié)果
圖5、BfmA直接結(jié)合bfmA和acoT啟動子區(qū)域并調(diào)控生物膜形成。電泳遷移率變動分析(EMSA)顯示，BfmA可直接結(jié)合bfmA自身(A)和acoT(B)的啟動子區(qū)域。實驗使用4 fmol[γ-32P]ATP標(biāo)記的bfmA和acoT啟動子區(qū)域DNA序列。遞增濃度的未標(biāo)記探針(10-1000倍)作為競爭劑與BfmA蛋白結(jié)合。各圖右側(cè)黑色三角形標(biāo)示BfmA-DNA結(jié)合復(fù)合物。(C)bfmA對acoT具有上位效應(yīng)，共同參與生物膜形成。測定不同菌株的生物膜形成量：IFD-acoT為acoT框內(nèi)缺失突變體；IFD-acoT-acoT和IFD-bfmA-acoT分別為攜帶Plac啟動子控制的全長acoT基因的acoT和bfmA突變體。所有菌株(包括野生型)均含有相應(yīng)空白或重組pBBRMCS2載體。
總結(jié)
革蘭氏陰性菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)存在于多種生態(tài)位中。由于其強大的生物膜形成能力和對多種抗生素的耐藥性，該菌已成為免疫系統(tǒng)受抑制或受損患者健康的嚴重威脅。除組氨酸激酶RpfC外，雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)作為大多數(shù)細菌病原體使用的典型調(diào)控機制，在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌中尚未通過實驗研究。本研究在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌基因組中注釋了62個推定組氨酸激酶基因，并通過系統(tǒng)性插入失活成功獲得了51個突變體。表型鑒定發(fā)現(xiàn)了一系列在細菌生長、游動能力和生物膜發(fā)育方面存在缺陷的突變體。通過遺傳驗證，確定了一個名為BfmA-BfmK(Smlt4209-Smlt4208)的TCS調(diào)控嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌生物膜形成。結(jié)合相互作用伙伴預(yù)測和染色質(zhì)免疫沉淀篩選，鑒定了6個在體內(nèi)被BfmA結(jié)合的候選啟動子區(qū)域。Bioscreen C系統(tǒng)為本研究提供了精確的細菌生長數(shù)據(jù)，幫助研究人員評估突變體的生長特性，排除生長差異對表型分析的干擾，并為后續(xù)的分子機制研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持。研究證明，BfmA作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合bfmA-bfmK和Smlt0800(acoT)的啟動子區(qū)域(后者編碼與生物膜發(fā)育相關(guān)的酰基輔酶A硫酯酶)，并正向調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。組氨酸激酶基因的全基因組突變分析及BfmK-BfmA在生物膜中的功能解析，為深入研究嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的細胞信號傳導(dǎo)提供了遺傳信息，有助于開發(fā)針對這一重要細菌病原體的新方法。