1.6測序和序列分析
將PCR產(chǎn)物陽性條帶切膠回收純化（膠回收試劑盒），連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過菌液PCR篩選陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析。
1.7生化試驗(yàn)
參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第九版），使用細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行測試：
葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)
乳糖發(fā)酵試驗(yàn)
精氨酸水解試驗(yàn)
明膠液化試驗(yàn)
尿素酶試驗(yàn)
甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)
操作方法：
葡萄糖、乳糖、精氨酸、甘露醇鑒定管：加入100μL M.bovis菌懸液（約10?CCU/mL），37℃培養(yǎng)3天。
明膠液化鑒定管：加入M.bovis菌懸液，37℃培養(yǎng)3天后置4℃冰箱30 min觀察。
尿素酶試驗(yàn)：用無菌接種針挑取菌落穿刺接種，37℃培養(yǎng)3天。
結(jié)果判定依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。
1.8生長曲線繪制
取培養(yǎng)至對數(shù)中期的二級種子液，按2.5%(V/V)的接種量接種于新鮮PPLO液體培養(yǎng)基（含20%馬血清），置37℃恒溫?fù)u床（120 rpm）培養(yǎng)。在接種后0,3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60 h取樣，立即進(jìn)行顏色變化單位（Colour Change Unit,CCU）測定。每次取樣設(shè)置3個平行。
CCU測定方法（改進(jìn)版）：取12支裝有0.9 mL PPLO液體培養(yǎng)基的試管。在第1管中加入0.1 mL待測樣品，混勻。吸取0.1 mL此混合液至第2管，混勻。依此類推，進(jìn)行10倍系列稀釋至第11管（第11管棄去0.1 mL）。第12管不接種作為陰性對照。所有試管置37℃靜置培養(yǎng)。每日觀察并記錄管中培養(yǎng)基由紅變黃的終點(diǎn)。以發(fā)生顏色變化的最高稀釋度（即終點(diǎn)管）計算CCU。例如：第1至第8管變色，第9、10管未變色，則原樣品的CCU為1×10?CCU/mL。每個樣品測定3次，計算LOG CCU/mL（以10為底），繪制生長曲線。
1.9致病性試驗(yàn)
試驗(yàn)動物：選擇4頭2~3月齡的健康斷奶犢牛（經(jīng)臨床檢查及鼻拭子PCR檢測確認(rèn)無M.bovis感染）。
分組與處理：隨機(jī)分為2組，每組2頭。感染組：通過氣管注射方式接種10 mL M.bovis YJ-22菌懸液（濃度1×101?CCU/mL，懸浮于PPLO培養(yǎng)基），連續(xù)攻毒3天（每天一次）。對照組：氣管注射10 mL無菌PPLO液體培養(yǎng)基，操作同感染組。
臨床觀察：攻毒前3天至攻毒后21天，每日觀察并記錄牛只的體溫（每日上午固定時間）、精神狀態(tài)、呼吸頻率與深度、咳嗽（頻率、嚴(yán)重程度）、關(guān)節(jié)腫脹情況、鼻腔分泌物（性質(zhì)、量）等臨床癥狀。
排菌檢測：分別在攻毒前（0d）、攻毒后第1,2,3,4,7,10,13,16,19,22 d采集所有試驗(yàn)牛的鼻拭子。鼻拭子樣品用于病原分離培養(yǎng)及PCR鑒定。
病理學(xué)檢查：攻毒21 d后，對所有試驗(yàn)牛實(shí)施安樂死并進(jìn)行剖檢。觀察肺部及其他組織器官的大體病變，重點(diǎn)記錄肺部損傷情況，參照Maunsell等描述的病變判分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺部病變評分（Gross lung lesion scores）。取有代表性的肺組織（病變區(qū)及交界區(qū)）浸泡于4%多聚甲醛中固定，送武漢賽維爾生物科技有限公司制作石蠟切片，進(jìn)行H&E染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。
1.10免疫原性驗(yàn)證試驗(yàn)
疫苗制備：將M.bovis YJ-22分離株接種于PPLO液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)30 h（達(dá)平臺期），測定菌液濃度為1×10?CCU/mL。8000×g離心20 min收集菌體，用無菌PBS(pH 7.2)洗滌3次。用含2 mmol/L二乙烯亞胺（Binary Ethyleneimine,BEI）的PBS懸浮菌體至原體積，37℃滅活24 h。滅活后與201油乳佐劑按55:45(V/V)的比例乳化，制成滅活疫苗。
動物免疫：選用10只體重約1.5 kg的雄性健康新西蘭白兔（血清學(xué)檢測M.bovis抗體陰性），隨機(jī)分為2組，每組5只。
免疫組：頸部皮下注射制備的YJ-22滅活疫苗1 mL。
陰性對照組：頸部皮下注射無菌生理鹽水1 mL。
21 d后，按相同途徑和劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
抗體檢測：二免后14 d，心臟采血，分離血清。
ELISA抗原：用YJ-22全菌經(jīng)超聲破碎處理后作為包被抗原（最佳條件需優(yōu)化）。
ELISA檢測：采用間接ELISA法。將抗原包被酶標(biāo)板（4℃過夜），封閉后，將待檢兔血清進(jìn)行2倍比稀釋（1:2至1:256），加入孔中孵育，洗滌后加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗孵育，最后加入TMB底物顯色，H?SO?終止，讀取OD450nm值。
效價判定：以陰性對照平均OD值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為臨界值（Cut-off）。血清抗體的終點(diǎn)效價定義為產(chǎn)生大于或等于Cut-off值的最高稀釋度的倒數(shù)（≥Cut-off值）。
1.11兔抗血清體外殺菌試驗(yàn)
血清處理：取高免的M.bovis陽性兔血清（來自免疫原性試驗(yàn)中抗體效價≥1:64的兔）及陰性兔血清，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，隨后經(jīng)0.22μm濾膜除菌。
菌液準(zhǔn)備：將M.bovis YJ-22分離株37℃培養(yǎng)30 h，用無菌PPLO液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋5個梯度（10?,10?1,10?2,10?3,10??，約為1×10?~1×10?CCU/mL）。
殺菌處理：將每個稀釋度的菌液分別與處理后的陽性兔血清或陰性兔血清按1:1(V/V)比例混合（例如：100μL菌液+100μL血清），輕輕混勻。
孵育：37℃孵育2小時。
CCU測定：孵育結(jié)束后，立即對每個混合樣品（菌+陽性血清或菌+陰性血清）進(jìn)行CCU測定（方法同1.8）。
存活率計算：M.bovis存活率(%)=(經(jīng)陽性兔血清處理后樣品測得的CCU/經(jīng)陰性兔血清處理后樣品測得的CCU)×100%。對每個稀釋度的結(jié)果分別計算存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.12統(tǒng)計學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。CCU測定結(jié)果取LOG值表示。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。致病性研究中體溫變化采用時間序列圖展示?？贵w效價描述抗體分布情況。殺菌試驗(yàn)存活率數(shù)據(jù)結(jié)合圖表描述。
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