摘要：
牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）是支原體屬中致病性較強的物種之一，可引起牛以肺炎為主的多種亞急性或慢性傳染病，嚴重阻礙全球養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展。本研究從廣東陽江患嚴重肺炎的病死牛肺臟中成功分離出一株牛支原體（編號YJ-22）。通過菌落形態(tài)觀察、特異性PCR（靶標P48基因，片段約526 bp）及測序比對（同源性>99.3%）、生化鑒定（符合牛支原體特征：不能利用葡萄糖、精氨酸、明膠、尿素、甘露醇，可利用乳糖）確認其種屬。繪制該分離株的生長曲線顯示，其在PPLO培養(yǎng)基中于18至45小時活菌數維持在1×10?~1×10?CCU/mL。致病性試驗表明，通過氣管注射10 mL 1×101?CCU/mL菌液連續(xù)攻毒3天，可使2~3月齡斷奶犢牛出現(xiàn)典型臨床癥狀（發(fā)熱、咳嗽、喘氣、鼻腔黏液增多）和肺部典型病變（肉眼可見肉變、出血，肺部病變評分9分和11分，組織學可見肺結構破壞、炎癥浸潤、增生）。鼻拭子排菌檢測呈陽性。利用BEI滅活的YJ-22菌體制備滅活疫苗免疫兔子，誘導產生特異性IgG抗體（效價≥1:64），表明其具有免疫原性。但體外殺菌試驗顯示，該陽性兔血清對YJ-22的生長無抑制效應（存活率100%）。本研究為M.bovis的高密度培養(yǎng)、致病機制研究及疫苗（特別是以兔子為模型篩選疫苗株或抗原）研發(fā)提供了重要基礎。
引言
牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）被認為是支原體屬支原體科中致病性較強的物種之一。M.bovis可引起以肺炎為主的亞急性或慢性傳染病，還能導致多種其他癥狀，包括關節(jié)炎、乳腺炎、結膜炎、耳炎和妊娠母牛流產等。此外，M.bovis可引起無癥狀感染，并長期定殖于鼻腔。該病原于1960年代在美國感染牛乳腺炎的病例中首次被檢測出，此后在全球大多數國家均有報道。我國于1983年首次從患乳腺炎的病牛中分離到M.bovis，2008年相繼報道從肉牛和犢牛肺臟中分離到該病原。目前，全國各地均有M.bovis肺炎疫情的報道。自首次報道以來，M.bovis肺炎已嚴重阻礙了全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。
支原體是最小的自我復制的原核生物，直徑為0.2~0.3μm，基因組較小（500~2500 kb環(huán)狀雙股DNA），僅含有500~1000個基因。由于其遺傳信息有限，支原體缺乏許多酶活性和代謝途徑，導致其營養(yǎng)需求復雜，高度依賴宿主，在體外難以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，M.bovis亦不例外。為此，我們對新分離的M.bovis進行了生長特性研究，以期為其高密度培養(yǎng)提供依據。
支原體缺乏細胞壁，因此對許多靶向細胞壁合成的抗生素（如β-內酰胺類、糖肽類如桿菌肽）不敏感。它對多粘菌素、磺胺類、第一代喹諾酮類藥物和甲氧芐啶等也具有天然抗性。此外，支原體也容易對其他抗菌藥物產生耐藥性。因此，研制預防牛支原體肺炎的疫苗迫在眉睫。目前市場上尚無商品化的M.bovis疫苗，這與其缺乏能穩(wěn)定復現(xiàn)疾病的理想動物攻毒模型密切相關。本研究在分離鑒定的基礎上，分析了新分離株YJ-22對犢牛的致病性，并使用兔子模型初步驗證了其免疫原性，以期為M.bovis疫苗的研制提供基礎。
1材料與方法
1.1病料來源
采集自廣東陽江某牛場患嚴重肺炎的病死牛肺臟組織。病牛臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、有濃鼻液、消瘦等。
1.2主要試劑
PPLO培養(yǎng)基購自美國BD公司；馬血清購自美國Cytiva公司；細菌DNA提取試劑盒購自Omega Bio-Tek公司；2×Taq PCR MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司。
1.3病料處理
無菌條件下將采集的肺組織切成小塊，取約1 g肺組織加入2 mL含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS，研磨后6000×g離心10 min，收集上清液，用0.45μm濾膜過濾后備用。
1.4病原分離與純化
將1.3處理好的肺臟上清液接種到PPLO液體培養(yǎng)基中（含20%馬血清），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48 h觀察顏色變化并傳代。取培養(yǎng)基顏色由紅變黃且保持澄清者，傳至3代后，取變黃的培養(yǎng)物涂布于PPLO固體培養(yǎng)基（含20%馬血清）中。3~5 d后，肉眼觀察菌落生長情況并在40-100X顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，挑取典型的“煎蛋樣”（Fried-egg）菌落接種到PPLO液體培養(yǎng)基中。待生長后再次接種固體培養(yǎng)基，重復此“液體-固體”克隆純化過程3次，獲得純培養(yǎng)物。
1.5 PCR鑒定
參照已發(fā)表文獻，合成M.bovis特異性檢測引物MB-P48-F/MB-P48-R（委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。MB-P48-F：5'-CCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT-3'；MB-P48-R：5'-CTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG-3'。預期擴增片段約526 bp。反應體系（20μL）：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上、下游引物（10μM）各0.5μL，模板2μL，ddH?O 7μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
相關新聞推薦
1、牛皮膚結節(jié)病毒分離鑒定、生長曲線、免疫熒光、TCID50測定（一）