3討論
APP引起豬的傳染性胸膜肺炎，在全球范圍內(nèi)分布廣泛。APP血清型眾多，具體流行情況又根據(jù)時(shí)間和地區(qū)的不同而存在顯著差異，其疫苗菌株需要根據(jù)流行毒株的變化而不斷更新。隨著時(shí)間變化，近幾年國內(nèi)5型、8型及15型等血清型也表現(xiàn)出流行趨勢(shì)，而3型菌株檢出率有所降低。國內(nèi)現(xiàn)有的商品化滅活疫苗主要針對(duì)血清型1、2、7型，而本研究從2021—2022年采集鑒定到的53株APP臨床菌株鑒定到1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，以1型和7型為主，5型和15型次之，8型相對(duì)較少，未檢測(cè)到血清型2型和3型。目前商品化疫苗可能不能再滿足臨床APP防控需求，需要更新疫苗候選毒株。
為了探究分離菌株的生物學(xué)特性，首先對(duì)臨床菌株的生長(zhǎng)曲線、溶血活性及耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15型菌株體外生長(zhǎng)速率最快。結(jié)合國內(nèi)APP的流行趨勢(shì)，近年來，包括15型菌在內(nèi)的10型之后的血清型流行率明顯增加，這提示15型菌株在自然環(huán)境中可能具備較強(qiáng)的生存競(jìng)爭(zhēng)力，其快速生長(zhǎng)的特性可能有助于其在宿主體內(nèi)迅速增殖，從而增加了其成為臨床感染中主要血清型的潛在風(fēng)險(xiǎn)。在APP治療手段方面，抗生素使用仍然重要手段，2014—2015年安徽地區(qū)分離到的臨床APP菌株對(duì)氟苯尼考都較為敏感，但近年來，APP對(duì)氯霉素類藥物耐藥性呈上升趨勢(shì)。本研究對(duì)臨床菌株耐藥性檢測(cè)結(jié)果表明臨床APP對(duì)恩諾沙星、青霉素、頭孢噻呋最為敏感，而對(duì)多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶的耐藥性明顯升高，這可能與當(dāng)?shù)嘏R床上藥物的使用頻率增加有關(guān)。
大蠟螟較容易獲取，并且在實(shí)驗(yàn)室條件下易于養(yǎng)殖，目前已廣泛用于各種大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，也是APP等病原菌毒力初步檢測(cè)的重要模型之一。該模型在樣本數(shù)量大的毒力評(píng)估實(shí)驗(yàn)中有突出優(yōu)勢(shì)，操作方便，在本研究中顯著降低了疫苗菌株篩選成本。雖然大蠟螟在毒力評(píng)估、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)等方面可以作為模型生物，但其生理和行為特性在某些情況下可能與更高級(jí)的模型生物有所不同，這限制了其在不同研究領(lǐng)域的適用性。因此，本研究首先使用大蠟螟幼蟲初篩數(shù)量較多的血清1型、7型菌株，然后利用小鼠模型進(jìn)一步篩選出1型、5型、7型和15型強(qiáng)毒株各一株，二者結(jié)果相結(jié)合分析，提高了毒力篩選的效率和正確率。國內(nèi)現(xiàn)有的商品化滅活疫苗主要針對(duì)血清型1、2、7型。有學(xué)者將分離到的APP血清型12菌株制備滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)其對(duì)1型APP感染小鼠產(chǎn)生40%的保護(hù)率，但對(duì)5b型APP感染不能提供有效的保護(hù)效力。這顯示不同血清型菌株的交叉保護(hù)效果較差。血清型15型在近幾年分離率逐漸升高，王玉國等已證明15型成為河南省優(yōu)勢(shì)血清型。2024年新疆某豬場(chǎng)爆發(fā)豬傳染性胸膜肺炎，分離鑒定確定流行菌株為15型。本研究將篩選出的各血清型候選菌株制備成單價(jià)滅活疫苗，并在小鼠上評(píng)價(jià)了免疫保護(hù)效果。對(duì)于15型臨床分離菌株，攻毒后，臨床菌株組小鼠存活率（66.7%）高于商品化疫苗免疫組（50%），因此商品化疫苗中1、2、7型對(duì)15型具有一定的交叉保護(hù)作用，但本研究結(jié)果獲得的15型菌株保護(hù)力更高，這些結(jié)果為血清15型的疫苗研制提供參考。而對(duì)于長(zhǎng)期流行的血清型1型臨床菌株，本研究中的菌株免疫劑量不到商品化疫苗中1型菌株的1/5，保護(hù)效果卻與商品化疫苗均達(dá)到100%，這表明該菌株具有很好的疫苗開發(fā)潛力，可以通過優(yōu)化疫苗各組分劑量來提高免疫保護(hù)效果。同時(shí)，本試驗(yàn)采用的氫氧化鋁作為疫苗佐劑，在滅活疫苗制備中廣泛應(yīng)用，其主要優(yōu)勢(shì)在于能夠顯著增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。但在強(qiáng)化細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面效果不那么顯著，不同佐劑的選擇在滅活疫苗的研究中也影響抗原免疫原性，也可能是臨床分離株滅活疫苗和商品化疫苗存在差異的原因。后續(xù)可對(duì)不同的佐劑和滅活方式進(jìn)行評(píng)估，從而制備對(duì)APP感染更佳保護(hù)效果的疫苗。
4結(jié)論
本研究從國內(nèi)十個(gè)省份的豬場(chǎng)分離菌株中鑒定到APP 1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，各血清型菌株在體外生長(zhǎng)存活能力強(qiáng)，具有不同程度的溶血活性。用大蠟螟和小鼠感染模型在血清型1、5、7、15型中各篩選到一株高毒力滅活疫苗候選菌株。其中，1型菌株滅活后能夠以小于商品化疫苗中1型菌株的1/5的劑量，在同血清型攻毒實(shí)驗(yàn)中保護(hù)100%小鼠存活，15型菌株為商品化疫苗菌株中缺乏的菌株，其制備的滅活疫苗也能對(duì)同血清型攻毒小鼠提供保護(hù)，這些菌株具備開發(fā)為疫苗候選菌株的潛在價(jià)值。
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