摘要［目的］為鑒定造成湛江某養(yǎng)殖場斜帶石斑魚大量死亡的病原，對皮膚滋生白色隆起疥瘡的患病斜帶石斑魚進(jìn)行解剖與細(xì)菌分離與純化。［方法］通過生化反應(yīng)、16SrRNA基因克隆與測序，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定分離純化獲得的優(yōu)勢菌S1。采用OD600和平板活菌計數(shù)繪制V.harveyiS1生長曲線，以R2判斷其生長曲線的相關(guān)性和可信度。［結(jié)果］鑒定結(jié)果顯示S1為哈維氏弧菌，同V.harveyihq-V149聚為一支。藥敏試驗結(jié)果顯示，斜帶石斑魚源的哈維氏弧菌S1對諾氟沙星、頭孢氨芐、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等12種抗生素敏感，對青霉素G、氨曲南、鏈霉素、頭孢唑林、頭孢哌酮等12種抗生素不敏感。［結(jié)論］哈維氏弧菌S1是造成湛江某養(yǎng)殖場斜帶石斑魚大量死亡的病原，其指數(shù)生長時間為5～12h，隨后進(jìn)入平臺期。
斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）又稱青斑，是鱸形目鮨科下石斑魚屬物種，作為海水養(yǎng)殖代表物種之一，同大黃魚、金槍魚等經(jīng)濟(jì)物種一樣具有高經(jīng)濟(jì)價值。人工養(yǎng)殖石斑魚已有20多年歷史，國內(nèi)石斑魚養(yǎng)殖多集中在廣東、海南、福建。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的提高和養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量穩(wěn)步提升，2017年石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量，其中廣東養(yǎng)殖規(guī)模最大，到2022年廣東地區(qū)石斑魚年產(chǎn)量達(dá)到93 024萬t，占全球養(yǎng)殖規(guī)模的45.57%。然而種質(zhì)的退化、環(huán)境的污染以及超出環(huán)境容量的養(yǎng)殖密度導(dǎo)致石斑魚病害頻發(fā)，2021年廣東水產(chǎn)養(yǎng)殖中有約50%的經(jīng)濟(jì)損失由病害造成。
石斑魚最主要的養(yǎng)殖模式是海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖，其次是池塘養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖。高密度、高污染的養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的富營養(yǎng)化造成水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能的變化，在海洋中廣泛分布的弧菌已經(jīng)成為海洋養(yǎng)殖的主要病原之一。部分病原性弧菌能跨物種感染，弧菌中的哈維氏弧菌正是能跨物種感染的病原弧菌之一。
哈維氏弧菌能感染魚類、蝦類和貝類，甚至能感染海馬，患病動物源自天津、廣東、海南等多地。在石斑魚上，持續(xù)報道患病石斑魚體內(nèi)分離出哈維氏弧菌。而在斜帶石斑魚上，早在2004年，便有從患病斜帶石斑魚肝臟分離出哈維氏弧菌的報道，2021年又有斜帶石斑魚源哈維氏弧菌分離報道。哈維氏弧菌跨物種感染能力之強，地理分布之廣，病害泛濫時間之久，都證明其作為病原對石斑魚養(yǎng)殖的負(fù)面影響之大。
近期，湛江某養(yǎng)殖場斜帶石斑魚發(fā)病，出現(xiàn)魚體體表發(fā)黑、潰爛現(xiàn)象，同時伴有白色隆起疥瘡滋生。為研究其病因，筆者對該養(yǎng)殖場發(fā)病斜帶石斑魚進(jìn)行致病菌分離、純化，觀察其形態(tài)特征。后通過分子技術(shù)和生理生化反應(yīng)進(jìn)一步對該分離菌株進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其中優(yōu)勢株S1為哈維氏弧菌，并根據(jù)16SrRNA基因序列多序列比對結(jié)果以Neighbor-Joining法構(gòu)建斜帶石斑魚源哈維氏弧菌S1的系統(tǒng)進(jìn)化樹，確認(rèn)哈維氏弧菌S1的進(jìn)化地位。同時繪制哈維氏弧菌S1的生長曲線，檢測哈維氏弧菌S1的耐藥性。以期為后續(xù)對哈維氏弧菌S1的深入研究提供基礎(chǔ)，為探尋斜帶石斑魚養(yǎng)殖過程哈維氏弧菌防治提供參考。
1材料與方法
1.1試驗材料
于湛江某養(yǎng)殖基地取樣3條（5.52±0.20）cm，患病斜帶石斑魚分別標(biāo)記為Ec1、Ec2、Ec3。一次性涂布棒、16S通用引物、微量細(xì)菌生化反應(yīng)管（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、藥敏紙片（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、TSA瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、TCSB瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基。
1.2試驗方法
1.2.1魚病診斷。對Ec1、Ec2、Ec3進(jìn)行目檢和剖檢，將檢查結(jié)果與健康斜帶石斑魚進(jìn)行比較，記錄病變組織和組織結(jié)構(gòu)上的病理變化。
根據(jù)檢查結(jié)果對病原進(jìn)行初步判斷。
1.2.2細(xì)菌分離與純化。
對Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個出現(xiàn)病理變化的部位在TSA平板、LB平板、TCSB平板劃線接種，接種平板于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察平板上菌落的大小、顏色和形態(tài)并記錄，挑取固體培養(yǎng)基上不同區(qū)域一定數(shù)量的單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。在菌液中添加等體積濃度為40%的滅菌甘油，于-80℃保存。