A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）屬于RNA病毒科（Picornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus）成員，目前僅有一個型，與心病毒屬（Cardioviruses）成員親緣關(guān)系較近。SVA感染可引起豬口鼻部及冠狀帶出現(xiàn)水泡樣病變，同時可伴隨跛行、厭食、嗜睡、皮膚充血、發(fā)熱等癥狀，與口蹄疫（FMD）、豬水泡病（SVD）、水泡性口炎（VS）等疫病難以區(qū)分。SVA為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約7.3 kb，包含由666個核苷酸組成的5'端非編碼區(qū)（UTR）。非編碼區(qū)后是1個單一的長開放閱讀框，編碼2 181個氨基酸組成的多聚蛋白，可被切割成12個多肽，包括先導(dǎo)蛋白（L）、4個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。SVA 3'端非編碼區(qū)有71個核苷酸，后面連有poly（A）尾巴。


反向遺傳技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類RNA病毒研究。該技術(shù)可實現(xiàn)在分子水平上對病毒定向改造，為RNA病毒基因功能及致病機理研究、新型疫苗研制等提供了有效方法。RNA病毒的主要反向遺傳學方法是，基于質(zhì)粒系統(tǒng)遞送病毒全長cDNA，細胞內(nèi)cDNA能在RNA聚合酶啟動子的作用下被轉(zhuǎn)錄成為病毒RNA，這些RNA隨后被翻譯成多肽并被加工為成熟的病毒結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒RNA一起包裝成具有感染性的病毒粒子。據(jù)報道，已有的SVA反向遺傳平臺構(gòu)建主要基于酶切連接方法，這種方法是通過RT-PCR在體外擴增病毒基因片段，利用限制性內(nèi)切酶，特異性地將片段逐個構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，這種方法需要進行酶切、連接、單克隆鑒定、測序等復(fù)雜程序，出錯率高，耗時較長。


本研究擬利用同源重組法一次性將SVA全基因組片段、CMV啟動子、poly（A）尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）等元件整合進低拷貝載體pWSK-29中，構(gòu)建SVA全長感染性克?。╬WSK-29-SVA），并拯救出與親本毒株生物學功能一致的重組病毒（rSVA），以期縮短反向遺傳平臺構(gòu)建時間，為進一步研究SVA致病機理、研制新型疫苗奠定基礎(chǔ)。


1材料與方法


1.1材料


1.1.1病毒、細胞、載體SVA-GXT91毒株，由本實驗室分離、保存；BHK-21細胞、pWSK-29質(zhì)粒、EGFP N2質(zhì)粒，為本實驗室保存。


1.1.2主要試劑


病毒RNA/DNA核酸自動提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶、同源重組酶、DH5α感受態(tài)細胞，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Qiagen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；全自動微生物生長曲線分析儀，購自Bioscreen公司；DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000，購自Invitrogen公司；胎牛血清，購自金源康生物工程有限公司。


1.2方法


1.2.1引物設(shè)計構(gòu)建方案如下：以EGFP N2質(zhì)粒為模板，設(shè)計含有同源臂的CMV啟動子引物，以SVA-GXT91 RNA為模板設(shè)計含同源臂SVA基因全長引物（表1）。含同源臂的poly（A）尾巴+HDVr，由引物自結(jié)合擴增形成。

表1構(gòu)建SVA感染性克隆的引物序列


1.2.2感染性克隆構(gòu)建


以pWSK-29為載體，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建pWSK-29-SVA感染性克隆。以SVA-GXT91 RNA為模板，擴增SVA病毒基因片段；以引物為模板，自結(jié)合擴增poly（A）+HDVr；以EGFP N2質(zhì)粒為模板，擴增CMV啟動子。將pWSK-29載體酶切線性化，與SVA全基因組、CMV啟動子及poly（A）+HDVr按比例混合，在同源重組酶ExnaseMulitS催化下，37℃反應(yīng)30 min即可完成同源重組結(jié)合，實現(xiàn)體外環(huán)化。100μL感受態(tài)細胞置于冰上融化后，加入10μL構(gòu)建好的SVA感染性克隆質(zhì)粒，輕搖混勻，冰上靜置30 min；隨即在42℃水浴中熱激90 s，迅速置于冰上2 min，然后置于800μL無抗生素的LB培養(yǎng)液中37℃搖床震蕩（180 r/min）45 min；以4 000 r/min離心5 min，棄去部分上清，將剩余100μL液體吹吸混勻，涂布在氨芐抗性LB培養(yǎng)板上；將培養(yǎng)板倒置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，并于次日菌落長出后進行菌落PCR鑒定。



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