2結果與分析
2.1體外抑菌活性
基于MIC、MBC及細菌生長曲線綜合評估GD對副溶血弧菌的體外抑菌活性。采用刃天青試驗測定GD對副溶血弧菌的MIC，結果顯示GD濃度大于7.6 mg/mL時，菌液顯藍色(無細菌生長)，表明GD對副溶血弧菌的MIC為7.6 mg/mL(圖1A)。吸取MIC以上濃度的各孔菌液進行平板涂布，培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)藥液濃度大于15.2 mg/mL時，無菌落長出(圖1B)，說明該濃度為GD對副溶血弧菌的MBC。
通過測定GD作用下副溶血弧菌菌液的OD600值，繪制32 h內細菌的生長曲線，結果顯示3個GD處理組(MIC、1/2MIC、1/4MIC)菌液的OD600值均低于對照組，且藥物濃度越高其OD600值越低，其中MIC組的OD600值始終保持在較低水平(<0.1)(圖1C)，結果表明1/4MIC濃度以上的GD藥物能抑制副溶血弧菌的生長。考慮到抑菌機制研究，應選取對細菌生長干擾較小的濃度，因此選取1/4MIC濃度用于后續(xù)研究。
圖1 GD對副溶血弧菌的MIC(A)、MBC(B)及細菌生長曲線(C)
2.2電鏡觀察結果
基于掃描SEM和TEM，分析GD對副溶血弧菌細胞結構的影響。結果顯示，從掃描電鏡圖中可見，在無藥物處理條件下，副溶血弧菌形態(tài)飽滿均勻，外形圓潤，表面光滑平整(圖2A)，而在1/4MIC濃度的GD處理后，菌體細胞發(fā)生裂解，出現(xiàn)空洞或裂縫，大量胞內泄露物質黏附在細胞表面(圖2B)；從透射電鏡可以看出，未經藥物處理的對照組副溶血弧菌細胞結構完整，表面光滑，細胞內容物分布均勻(圖2C)，而GD處理組菌體細胞壁、細胞膜出現(xiàn)消融，細胞內出現(xiàn)大空泡，細胞質減少且分布不均(圖2D)。掃描電鏡和透射電鏡結果均表明，GD處理可破壞副溶血弧菌細胞結構完整性，影響細胞膜通透性，導致大分子物質泄露。
圖2副溶血弧菌細胞的掃描電鏡圖和透射電鏡圖
2.3轉錄組數(shù)據(jù)質控分析
為比較GD處理組和對照組副溶血弧菌轉錄組的差異，用NovaSeq X Plus平臺進行轉錄組測序，采用統(tǒng)計分析方法對質控后數(shù)據(jù)進行質量分析。結果顯示，質控后所有樣品均獲得2 000萬條以上Clean reads，堿基錯誤率均低于0.012 0%，質量大于99.90%的堿基占比(Q20)均超過98.76%；將質控后數(shù)據(jù)與參考基因組進行比對，所有樣品的比對率均大于88.80%(表2)，表明轉錄組測序質量可靠。
表2質控數(shù)據(jù)統(tǒng)計
2.4轉錄組總體差異分析
基于韋恩圖分析GD組和CK組副溶血弧菌基因數(shù)量的差異，結果顯示GD組和CK組分別有76個和83個特有基因，二者有4 501個共享基因(圖3A)。主成分分析(PCA)圖中可見，GD組和CK組樣品沿著解釋度高達81.32%的PC1軸明顯區(qū)分開(圖3B)，聚類熱圖也發(fā)現(xiàn)兩組樣品分別單獨聚類(圖3C)，表明GD組和CK組組間存在較大差異，且組內樣品的重復性較好。進一步基于DESeq2篩選出兩組間差異表達基因，并通過散點圖可視化顯著變化基因的數(shù)量及分布。結果顯示，與CK組相比，GD組有1 074個顯著上調基因，以及1 179個顯著下調基因，另有3 271個基因在兩組間無顯著差異(圖3D)。
圖3基于韋恩圖(A)、主成分分析圖(B)、聚類熱圖(C)和散點圖(D)表征GD組和CK組副溶血弧菌轉錄組的總體差異。TPM：Transcripts per million，每百萬個轉錄本中特定轉錄本的數(shù)量。
2.5差異表達基因的GO富集分析
通過goatools軟件對GD組和CK組組間差異表達基因進行GO富集分析，結果顯示GD組上調基因被顯著富集到79個GO功能(P<0.05)，通過氣泡圖展示富集程度前20的GO功能，主要涉及轉錄因子活性、細胞壁合成代謝等相關功能，包括轉錄調節(jié)因子活性(transcription regulator activity)、DNA結合轉錄因子活性(DNA-binding transcription factor activity)、肽聚糖生物合成過程(peptidoglycan biosynthetic process)、肽聚糖代謝過程(peptidoglycan metabolic process)、氨基聚糖生物合成過程(aminoglycan biosynthetic process)、氨基聚糖代謝過程(aminoglycan metabolic process)、細胞壁大分子生物合成過程(cell wall macromolecule biosynthetic process)、細胞壁組織或生物發(fā)生(cell wall organization or biogenesis)、細胞壁組織(cell wall organization)等(圖4A)。GD組下調基因被顯著富集到129個GO功能(P<0.05)，其中富集程度前20的主要為肌苷酸、核糖核苷合成代謝等相關功能，包括肌酐酸(inosine monophosphate,IMP)生物合成過程(IMP biosynthetic process)、IMP代謝過程(IMP metabolic process)、核糖核苷一磷酸代謝過程(ribonucleoside monophosphate metabolic process)、一磷酸核糖核苷生物合成過程(ribonucleoside monophosphate biosynthetic process)、嘌呤核苷一磷酸代謝過程(purine nucleoside monophosphate metabolic process)、嘌呤核糖核苷一磷酸生物合成過程(purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process)、嘌呤核糖核苷一磷酸代謝過程(purine ribonucleoside monophosphate metabolic process)、核糖磷酸代謝過程(ribose phosphate metabolic process)、核苷酸生物合成過程(nucleotide biosynthetic process)、核糖核苷酸代謝過程(ribonucleotide metabolic process)等(圖4B)。
圖4差異表達基因的GO富集分析。A：上調功能；B：下調功能。
2.6差異表達基因的KEGG富集分析
采用KOBAS軟件對GD組和CK組組間差異表達基因進行KEGG信號通路的富集分析，結果顯示GD組上調基因僅被顯著富集到肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)和萬福霉素抗藥性(vancomycin resistance)等2個KEGG通路(P<0.05)(圖5A)；GD組下調基因被顯著富集到檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、嘌呤代謝(purine metabolism)、雙組分系統(tǒng)(two-component system)、原核生物的碳固定途徑(carbon fixation pathways in prokaryotes)、細菌趨化性(bacterial chemotaxis)等通路(P<0.05)。此外，下調基因還涉及群體感應(quorum sensing)、志賀菌病(shigellosis)、軍團菌病(legionellosis)等通路，但這些通路并未達到顯著水平(P>0.05)(圖5B)。
圖5差異表達基因的KEGG富集。A：上調通路；B：下調通路。
2.7差異表達基因的RT-qPCR驗證結果
為驗證轉錄組測序數(shù)據(jù)的準確性，隨機選取6個顯著下調基因(gltD、gltB、hisC、cysE、ftsE和mcp)和6個顯著上調基因(VP2355、glgP、ftsY、fhuC、lolD和nrtC)進行RT-qPCR驗證試驗。結果顯示，與對照組相比，氨基酸代謝相關基因(gltD、gltB和hisC)、膜轉運相關基因(ftsE)以及細菌趨化性相關基因(mcp)在GD組中均顯著下調(P<0.05)，此外生物膜形成相關基因(cysE)在GD組中的表達水平也低于對照組，但未達到顯著水平(P>0.05)(圖6)；相反，鐵離子轉運相關基因(ftsY、fhuC、lolD和nrtC)在GD組中顯著上調(P<0.05)，此外蛋白質輸出相關基因(VP2355和glgP)在GD組中的表達水平高于對照組，但未達到顯著水平((P>0.05)(圖6)。RT-qPCR驗證試驗結果與轉錄組分析結果基本一致，表明轉錄組數(shù)據(jù)分析可信度較高。
圖6差異表達基因的RT-qPCR驗證
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