2結(jié)果與分析
2.1體外抑菌活性
基于MIC、MBC及細(xì)菌生長曲線綜合評(píng)估GD對(duì)副溶血弧菌的體外抑菌活性。采用刃天青試驗(yàn)測定GD對(duì)副溶血弧菌的MIC，結(jié)果顯示GD濃度大于7.6 mg/mL時(shí)，菌液顯藍(lán)色(無細(xì)菌生長)，表明GD對(duì)副溶血弧菌的MIC為7.6 mg/mL(圖1A)。吸取MIC以上濃度的各孔菌液進(jìn)行平板涂布，培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)藥液濃度大于15.2 mg/mL時(shí)，無菌落長出(圖1B)，說明該濃度為GD對(duì)副溶血弧菌的MBC。
通過測定GD作用下副溶血弧菌菌液的OD600值，繪制32 h內(nèi)細(xì)菌的生長曲線，結(jié)果顯示3個(gè)GD處理組(MIC、1/2MIC、1/4MIC)菌液的OD600值均低于對(duì)照組，且藥物濃度越高其OD600值越低，其中MIC組的OD600值始終保持在較低水平(<0.1)(圖1C)，結(jié)果表明1/4MIC濃度以上的GD藥物能抑制副溶血弧菌的生長。考慮到抑菌機(jī)制研究，應(yīng)選取對(duì)細(xì)菌生長干擾較小的濃度，因此選取1/4MIC濃度用于后續(xù)研究。
圖1 GD對(duì)副溶血弧菌的MIC(A)、MBC(B)及細(xì)菌生長曲線(C)
2.2電鏡觀察結(jié)果
基于掃描SEM和TEM，分析GD對(duì)副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，從掃描電鏡圖中可見，在無藥物處理?xiàng)l件下，副溶血弧菌形態(tài)飽滿均勻，外形圓潤，表面光滑平整(圖2A)，而在1/4MIC濃度的GD處理后，菌體細(xì)胞發(fā)生裂解，出現(xiàn)空洞或裂縫，大量胞內(nèi)泄露物質(zhì)黏附在細(xì)胞表面(圖2B)；從透射電鏡可以看出，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，細(xì)胞內(nèi)容物分布均勻(圖2C)，而GD處理組菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜出現(xiàn)消融，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大空泡，細(xì)胞質(zhì)減少且分布不均(圖2D)。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果均表明，GD處理可破壞副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，影響細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致大分子物質(zhì)泄露。
圖2副溶血弧菌細(xì)胞的掃描電鏡圖和透射電鏡圖
2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析
為比較GD處理組和對(duì)照組副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄組的差異，用NovaSeq X Plus平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，采用統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)質(zhì)控后數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析。結(jié)果顯示，質(zhì)控后所有樣品均獲得2 000萬條以上Clean reads，堿基錯(cuò)誤率均低于0.012 0%，質(zhì)量大于99.90%的堿基占比(Q20)均超過98.76%；將質(zhì)控后數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，所有樣品的比對(duì)率均大于88.80%(表2)，表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可靠。
表2質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
2.4轉(zhuǎn)錄組總體差異分析
基于韋恩圖分析GD組和CK組副溶血弧菌基因數(shù)量的差異，結(jié)果顯示GD組和CK組分別有76個(gè)和83個(gè)特有基因，二者有4 501個(gè)共享基因(圖3A)。主成分分析(PCA)圖中可見，GD組和CK組樣品沿著解釋度高達(dá)81.32%的PC1軸明顯區(qū)分開(圖3B)，聚類熱圖也發(fā)現(xiàn)兩組樣品分別單獨(dú)聚類(圖3C)，表明GD組和CK組組間存在較大差異，且組內(nèi)樣品的重復(fù)性較好。進(jìn)一步基于DESeq2篩選出兩組間差異表達(dá)基因，并通過散點(diǎn)圖可視化顯著變化基因的數(shù)量及分布。結(jié)果顯示，與CK組相比，GD組有1 074個(gè)顯著上調(diào)基因，以及1 179個(gè)顯著下調(diào)基因，另有3 271個(gè)基因在兩組間無顯著差異(圖3D)。
圖3基于韋恩圖(A)、主成分分析圖(B)、聚類熱圖(C)和散點(diǎn)圖(D)表征GD組和CK組副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄組的總體差異。TPM：Transcripts per million，每百萬個(gè)轉(zhuǎn)錄本中特定轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。
2.5差異表達(dá)基因的GO富集分析
通過goatools軟件對(duì)GD組和CK組組間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示GD組上調(diào)基因被顯著富集到79個(gè)GO功能(P<0.05)，通過氣泡圖展示富集程度前20的GO功能，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞壁合成代謝等相關(guān)功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性(transcription regulator activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(DNA-binding transcription factor activity)、肽聚糖生物合成過程(peptidoglycan biosynthetic process)、肽聚糖代謝過程(peptidoglycan metabolic process)、氨基聚糖生物合成過程(aminoglycan biosynthetic process)、氨基聚糖代謝過程(aminoglycan metabolic process)、細(xì)胞壁大分子生物合成過程(cell wall macromolecule biosynthetic process)、細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生(cell wall organization or biogenesis)、細(xì)胞壁組織(cell wall organization)等(圖4A)。GD組下調(diào)基因被顯著富集到129個(gè)GO功能(P<0.05)，其中富集程度前20的主要為肌苷酸、核糖核苷合成代謝等相關(guān)功能，包括肌酐酸(inosine monophosphate,IMP)生物合成過程(IMP biosynthetic process)、IMP代謝過程(IMP metabolic process)、核糖核苷一磷酸代謝過程(ribonucleoside monophosphate metabolic process)、一磷酸核糖核苷生物合成過程(ribonucleoside monophosphate biosynthetic process)、嘌呤核苷一磷酸代謝過程(purine nucleoside monophosphate metabolic process)、嘌呤核糖核苷一磷酸生物合成過程(purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process)、嘌呤核糖核苷一磷酸代謝過程(purine ribonucleoside monophosphate metabolic process)、核糖磷酸代謝過程(ribose phosphate metabolic process)、核苷酸生物合成過程(nucleotide biosynthetic process)、核糖核苷酸代謝過程(ribonucleotide metabolic process)等(圖4B)。
圖4差異表達(dá)基因的GO富集分析。A：上調(diào)功能；B：下調(diào)功能。
2.6差異表達(dá)基因的KEGG富集分析
采用KOBAS軟件對(duì)GD組和CK組組間差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路的富集分析，結(jié)果顯示GD組上調(diào)基因僅被顯著富集到肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)和萬福霉素抗藥性(vancomycin resistance)等2個(gè)KEGG通路(P<0.05)(圖5A)；GD組下調(diào)基因被顯著富集到檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、嘌呤代謝(purine metabolism)、雙組分系統(tǒng)(two-component system)、原核生物的碳固定途徑(carbon fixation pathways in prokaryotes)、細(xì)菌趨化性(bacterial chemotaxis)等通路(P<0.05)。此外，下調(diào)基因還涉及群體感應(yīng)(quorum sensing)、志賀菌病(shigellosis)、軍團(tuán)菌病(legionellosis)等通路，但這些通路并未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖5B)。
圖5差異表達(dá)基因的KEGG富集。A：上調(diào)通路；B：下調(diào)通路。
2.7差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取6個(gè)顯著下調(diào)基因(gltD、gltB、hisC、cysE、ftsE和mcp)和6個(gè)顯著上調(diào)基因(VP2355、glgP、ftsY、fhuC、lolD和nrtC)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氨基酸代謝相關(guān)基因(gltD、gltB和hisC)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(ftsE)以及細(xì)菌趨化性相關(guān)基因(mcp)在GD組中均顯著下調(diào)(P<0.05)，此外生物膜形成相關(guān)基因(cysE)在GD組中的表達(dá)水平也低于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖6)；相反，鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(ftsY、fhuC、lolD和nrtC)在GD組中顯著上調(diào)(P<0.05)，此外蛋白質(zhì)輸出相關(guān)基因(VP2355和glgP)在GD組中的表達(dá)水平高于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著水平((P>0.05)(圖6)。RT-qPCR驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可信度較高。
圖6差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證
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