[摘要]目的探討膀胱癌微環(huán)境中M2巨噬細(xì)胞通過(guò)CLDN10信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法收集2020年3-9月重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的10例膀胱癌患者的新鮮癌組織及癌旁組織標(biāo)本，免疫組化觀測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物在膀胱癌組織中的表達(dá)；對(duì)癌和癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出受巨噬細(xì)胞調(diào)控的潛在基因。采用CCK-8、細(xì)胞克隆、Western blot等方法觀測(cè)CLDN10對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用。結(jié)果巨噬細(xì)胞特征性分子CD68和M2型巨噬細(xì)胞CD163分子在膀胱癌組織中表達(dá)增加。對(duì)基因測(cè)序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)CLDN10基因在膀胱癌組織中表達(dá)最顯著，對(duì)膀胱癌組織免疫組化結(jié)果行免疫評(píng)分后發(fā)現(xiàn)CLDN10的表達(dá)與巨噬細(xì)胞在膀胱癌組織中的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明膀胱癌組織中CLDN10蛋白的表達(dá)水平較癌旁組織高(P<0.05)。敲低CLDN10的表達(dá)后，與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力下降，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明膀胱癌細(xì)胞形成細(xì)胞克隆數(shù)目降低(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05)，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白snail、twist、vimentin的表達(dá)水平降低，而E-cadherin的表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論巨噬細(xì)胞上調(diào)膀胱癌細(xì)胞CLDN10的表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
腫瘤微環(huán)境(tumor micro-environment，TME)是指腫瘤細(xì)胞所在的內(nèi)外環(huán)境，包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子構(gòu)成了腫瘤的免疫微環(huán)境，主要包括巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Treg細(xì)胞等。這些細(xì)胞具有促癌和抑癌的雙重調(diào)節(jié)作用，而這種調(diào)節(jié)作用主要取決于免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)和類別。如何提高TME中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用，是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)之一。例如，免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1單克隆抗體通過(guò)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用，獲得了顯著的臨床療效。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的研究越來(lái)越深入，人們意識(shí)到免疫細(xì)胞的調(diào)控功能越來(lái)越重要和復(fù)雜。
膀胱癌是中國(guó)人群泌尿系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，根據(jù)2016年CHEN等發(fā)布的2015中國(guó)癌癥發(fā)病情況，膀胱癌的發(fā)生率和死亡率正逐年升高。特別是晚期膀胱癌患者，傳統(tǒng)放、化療治療效果較差，而以PD-1/PD-L1單抗為代表的新型免疫治療的問(wèn)世無(wú)疑給晚期膀胱癌患者帶來(lái)了新的希望。盡管如此，目前的免疫治療方案仍面臨有效率不高、療效不確切等諸多問(wèn)題。要解決這些問(wèn)題，首先要深入研究膀胱癌瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的種類分布及其調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。因此，本研究探討膀胱癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在膀胱癌組織中浸潤(rùn)數(shù)量明顯增多；進(jìn)一步采用內(nèi)部測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出受巨噬細(xì)胞調(diào)控的潛在靶基因，并用外部測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可能通過(guò)CLDN10基因介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。
1資料與方法
1.1標(biāo)本來(lái)源
收集2020年3-9月重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性膀胱全切的10例膀胱癌患者癌組織和癌旁組織新鮮標(biāo)本，保存于福爾馬林標(biāo)本保存液或液氮中，分別用于免疫組化實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)。其中，男性8例，女性2例；年齡47~72歲，平均61.8歲。根據(jù)2010AJCC TNM分期，T1期1例，T2期8例，T3期1例；所有癌組織標(biāo)本經(jīng)病理診斷為尿路上皮癌。本研究經(jīng)重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021年2月)。
1.2膀胱癌細(xì)胞系
膀胱癌T24細(xì)胞株來(lái)源于中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞在含10%小牛血清、100 IU/mL青/鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為：37℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中。
1.3免疫組化檢測(cè)
將福爾馬林液固定過(guò)的膀胱癌組織標(biāo)本用石蠟包埋后切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、抗體孵育、DAB染色、封片等過(guò)程后，在顯微鏡下觀察染色情況。對(duì)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選癌組織和癌旁組織差異表達(dá)基因；依據(jù)膀胱癌組織中巨噬細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)弱進(jìn)行免疫評(píng)分，分為高低浸潤(rùn)組，采用軟件分析技術(shù)篩選出兩組間的差異表達(dá)基因。
1.4 Western blot檢測(cè)
將液氮中保存的膀胱癌組織標(biāo)本在液氮環(huán)境下研磨后加入RIPA細(xì)胞裂解液，并離心后分離提取出蛋白上清液。然后通過(guò)配制SDS電泳凝膠、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后，用CLDN10、Snail、Twist、E-cadherin、β-actin、GAPDH等抗體檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
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