摘要：為明確調(diào)理牛排的優(yōu)勢(shì)腐敗菌并篩選出抑菌性、專一性強(qiáng)的植物精油，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)基法結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)篩選出調(diào)理牛排的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并通過抑菌圈、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，從丁香精油、豆蔻精油、黑胡椒精油中選出抑菌性最強(qiáng)的植物精油。結(jié)果表明：優(yōu)勢(shì)腐敗菌為深藍(lán)紫色桿菌（Janthinobacterium lividum）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）；丁香精油的抑菌圈直徑均大于10 mm，2～4μL/mL的精油添加量就能明顯抑制優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖；豆蔻精油抑菌性稍弱；黑胡椒精油對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌均無(wú)明顯抑菌效果。
調(diào)理牛排烹飪簡(jiǎn)單、方便快捷、營(yíng)養(yǎng)美味，備受消費(fèi)者青睞，然而，在其加工及銷售過程中，由于自溶酶和微生物的作用，會(huì)不斷積累醛、酮、胺等有害物質(zhì)，導(dǎo)致牛肉顏色、質(zhì)地、氣味發(fā)生劣變，不適宜消費(fèi)者食用。在肉類微生物菌群中，優(yōu)勢(shì)腐敗菌能夠在低溫和長(zhǎng)時(shí)間貯藏條件下大量增殖，占據(jù)主導(dǎo)地位，最終導(dǎo)致食品腐敗。
目前，傳統(tǒng)培養(yǎng)基分離仍是篩選優(yōu)勢(shì)腐敗菌最常見的方法，但其分離出的菌株往往不能代表微生物菌群的真實(shí)分布情況。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)可以通過監(jiān)測(cè)微生物菌群組成變化判斷樣本中的優(yōu)勢(shì)菌，常用于研究白酒釀造、陳醋醋醅、土壤中的微生物菌群結(jié)構(gòu)及種群分析，但該技術(shù)無(wú)法檢測(cè)出DNA含量＜1.5%的物種，在全面揭示菌群多樣性上具有一定局限性。已經(jīng)有學(xué)者通過MRS平板分離結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測(cè)真空包裝豬肉的貯藏期，得到了優(yōu)勢(shì)菌群（清酒乳桿菌）。因此，傳統(tǒng)培養(yǎng)基結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)確定調(diào)理牛排中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，進(jìn)行特異性防腐是解決其貨架期較短的有效措施。
植物精油是從種子、花、莖、葉、果實(shí)中提取的具有特征香氣的揮發(fā)性液體，具有很強(qiáng)的生物活性，可以抑制由腸沙門氏菌和大腸桿菌侵害及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化引起的食品腐敗、變質(zhì)，是天然的抗菌劑和抗氧化劑，常被用來(lái)替代合成防腐劑。Manjankattil等發(fā)現(xiàn)，在火雞肉中添加辣椒精油能夠有效抑制其生產(chǎn)和加工過程中的耐藥沙門氏菌生長(zhǎng)。Buckiuniene等用羅勒精油腌制牛肉糜，發(fā)現(xiàn)處理后的牛肉蒸煮損失和霉菌/酵母數(shù)量比值顯著降低，牛肉品質(zhì)得到顯著提升。此外，Kasi等發(fā)現(xiàn)在花生油中添加具有強(qiáng)抗氧化活性（2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽(yáng)離子自由基清除能力）的生姜精油，能降低其受黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)，并有效延長(zhǎng)保質(zhì)期。然而，植物精油對(duì)調(diào)理牛排優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌性研究卻鮮有報(bào)道。
基于此，本研究擬通過傳統(tǒng)培養(yǎng)基法結(jié)合PCRDGGE技術(shù)驗(yàn)證調(diào)理牛排貯藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并引入丁香精油（clove essential oil，CEO）、豆蔻精油（cardamom seeds essential oil，CSEO）及黑胡椒精油（blank pepper essential oil，BPEO），以期通過抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出一種高效、精準(zhǔn)抑菌的植物精油，為調(diào)理牛排的特異性防腐提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
冷鮮調(diào)理牛排（牧童村菲力牛排）購(gòu)于石河子市友好超市。
PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MRS、STAA、CFC固體培養(yǎng)基、PCA技術(shù)瓊脂培養(yǎng)基、VRBA結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂（分析級(jí)）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒（50 preps）、2×Taq Master Mix北京天根生化科技（化工）有限公司；CEO、CSEO、BPEO多特瑞商貿(mào)有限公司；Gel-Green DNA染色劑、TE緩沖液上海麥克林生化科技股份有限公司；1×TAE電泳緩沖液美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
1.2儀器與設(shè)備
LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；S100 Themal Cycler PCR擴(kuò)增儀、UniversalHood11凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；ZHWY-118落地普通型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；DCodeTM System DGGE儀孚約生物科技（上海）有限公司；C h e m i S c o p e 6100化學(xué)發(fā)光儀上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。
1.3方法
1.3.1腐敗微生物的分離純化
無(wú)菌條件下稱取調(diào)理牛排20 g，放入裝有180 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中。密封后于拍擊式均質(zhì)器中破碎，每20 min停歇10 min，避免過熱，重復(fù)2次。取1 mL原液進(jìn)行梯度稀釋，選取3個(gè)合適稀釋度的樣品分別涂布于各選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上大小、形狀、顏色不同的菌落，通過平板劃線法對(duì)其進(jìn)行純化，得到單一菌落。各選擇性培養(yǎng)基的目標(biāo)腐敗菌和培養(yǎng)條件如表1所示。
表1調(diào)理牛排腐敗菌的篩選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
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