2.4噬菌體全基因組分析
2.4.1噬菌體PC79-13的進(jìn)化分析
噬菌體PC79-13基因組序列全長(zhǎng)為86 886 bp(GenBank登錄號(hào)為OR687644.2)，在其基因組中未發(fā)現(xiàn)mcr-1(黏菌素耐藥基因)，qnr(喹諾酮類耐藥基因)，sul1、sul2、sul3(磺胺類耐藥基因)，floR(氯霉素抗性基因)，同時(shí)不含有過敏原相關(guān)基因，因此在生物安全上不存在隱患。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，噬菌體PC79-13的基因組DNA與大腸桿菌噬菌體SUSP2的基因組DNA高度相似(相似性96.67%，覆蓋率94%，登錄號(hào)NC 028935.2)，同時(shí)與大腸桿菌噬菌體CHB7的基因組DNA相似度也較高(相似性96.65%，覆蓋率91%，登錄號(hào)MK562504.1)?；谌蚪M進(jìn)化樹分析比對(duì)(圖7)可知噬菌體PC79-13與大腸桿菌SUSP2親緣性最高，屬于同一分支，即雙鏈DNA病毒域，香港病毒界，有尾噬菌體門，有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，是一株未被發(fā)現(xiàn)的噬菌體。用OrthoANI算法對(duì)噬菌體PC79-13進(jìn)行分析，熱圖(圖8)顯示其與大腸桿菌SUSP2有最高同一性95.28。
圖7基于噬菌體PC79-13的全基因組構(gòu)建進(jìn)化樹
圖8噬菌體PC79-13的ANI分析
2.4.2噬菌體PC79-13的基因組功能注釋
噬菌體PC79-13基因組共預(yù)測(cè)了59個(gè)編碼區(qū)(CDS)，在這之中有23個(gè)CDS編碼功能蛋白，包括1個(gè)參與表達(dá)噬菌體裂解酶的CDS，4個(gè)參與編碼噬菌體結(jié)構(gòu)、組裝的CDS，16個(gè)參與編碼噬菌體基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)代謝的CDS，2個(gè)編碼其他功能蛋白的CDS。此外，基因組中還含有20個(gè)編碼tRNA的CDS(圖9)。
圖9噬菌體PC79-13的基因組圈圖
2.5 FITC標(biāo)記噬菌體
2.5.1 FITC標(biāo)記噬菌體用于暗場(chǎng)檢測(cè)沙門菌
FITC標(biāo)記的噬菌體PC79-13(經(jīng)宿主菌C79-13雙層板滴度測(cè)定，F(xiàn)ITC標(biāo)記噬菌體滴度為9.2×109 PFU/mL，約損失8%滴度)與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雞白痢沙門菌C79-13(菌濃度1.0×106 CFU/mL)混合于LB液體培養(yǎng)基中，孵育不同時(shí)間(10 min、15 min、20 min、25 min)后，用熒光顯微鏡觀察。由于在熒光顯微鏡鏡檢前已將未與宿主菌結(jié)合的噬菌體經(jīng)離心去除，因此熒光顯微鏡下觀察空白對(duì)照樣本與陰性對(duì)照中非宿主菌混合孵育的樣本應(yīng)不顯示任何短桿狀熒光。結(jié)果顯示:孵育15 min的陽性樣本，熒光顯微鏡下可見大量長(zhǎng)度為2~5μm的短桿狀熒光(圖10A)，與明場(chǎng)下細(xì)菌分布一致(圖10B)。而空白對(duì)照(只含有FITC標(biāo)記的噬菌體PC79-13)與陰性對(duì)照(含有FITC標(biāo)記的噬菌體PC79-13與非宿主細(xì)菌大腸桿菌CVCC1553孵育15 min)皆未觀察到棒狀熒光結(jié)構(gòu)(圖10C、D)，而將FITC標(biāo)記的噬菌體侵染其余宿主菌，孵育15 min后制片置于熒光顯微鏡下觀察，均可見清晰明亮的棒狀結(jié)構(gòu)，故表明FITC標(biāo)記的噬菌體PC79-13可用于定向檢測(cè)作為其宿主的一系列雞白痢沙門菌。分析熒光顯微鏡下熒光棒狀結(jié)構(gòu)的多少及清晰度結(jié)果表明:同樣條件下，孵育15 min，有最多、最完整清晰的熒光圖像。孵育10 min，視野下熒光棒狀結(jié)構(gòu)較少;孵育20 min及25 min，有大量不完整的熒光碎片狀結(jié)構(gòu)。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為15 min。
圖10熒光標(biāo)記噬菌體侵染宿主菌和非宿主菌顯微(熒光和明場(chǎng))觀察(1 000×)
A、B:FITC-噬菌體侵染宿主菌熒光顯微觀察與明場(chǎng)觀察C、D:FITC-噬菌體侵染非宿主菌熒光顯微觀察與明場(chǎng)觀察
此外，我們也探索了FITC標(biāo)記噬菌體的活性保存時(shí)間。在4個(gè)不同保存時(shí)間點(diǎn)(1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月)，取4℃避光保存的FITC標(biāo)記噬菌體，利用宿主菌雙層板測(cè)滴度。噬菌斑計(jì)數(shù)結(jié)果表明:保存1個(gè)月，噬菌體的滴度僅有約5%下降。但2個(gè)月卻出現(xiàn)40%下降。2個(gè)月滴度下降明顯的原因，可能是實(shí)驗(yàn)室潔凈度不夠，在操作中混入了其他細(xì)菌，導(dǎo)致噬菌體溶液的物質(zhì)內(nèi)容發(fā)生了變化，使近半數(shù)FITC標(biāo)記的噬菌體失活。后續(xù)我們還要進(jìn)行更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋４鏃l件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以確定FITC標(biāo)記噬菌體活性保持的最佳條件。
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