摘要用液體侵染法從黃海分離出一株能夠侵染聚球藻WH8102的噬藻體S-H35。電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，S-H35屬于短尾科噬藻體。噬藻體S-H35的一步生長(zhǎng)曲線顯示其潛伏期約為4 h，爆發(fā)期約為8 h，裂解量為125。S-H35的基因組分析結(jié)果顯示，其基因組長(zhǎng)度為175，321 bp，共含有228個(gè)ORF，GC含量為41.51%?；蚬δ芊譃槭稍弩w的結(jié)構(gòu)、吸附相關(guān)、組裝、DNA復(fù)制及修復(fù)、末端酶、與宿主生理活動(dòng)相關(guān)的基因等。噬藻體S-H35與已知的噬藻體進(jìn)一步的基因比對(duì)結(jié)果并未顯示出明顯同源性。


聚球藻（Synechococcus）是海洋藍(lán)細(xì)菌最主要的類群之一，也是超微型浮游生物中的優(yōu)勢(shì)組分，廣布于世界各大洋，它們?cè)诤Ｑ笾胸S度極高，在熱帶和溫帶海洋中的豐度通常在103～105個(gè)/mL。聚球藻能量轉(zhuǎn)換迅速，在開(kāi)放海域中的初級(jí)生產(chǎn)力可以達(dá)到總初級(jí)生產(chǎn)力的25%，是全球海洋中主要的初級(jí)生產(chǎn)者之一。此外，聚球藻是由2～4個(gè)單細(xì)胞組成的，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)，因此一直是研究病毒感染的理想宿主。


噬藻體（Cyanophage）是一類能夠感染聚球藻、原綠球藻（Prochlorococcus）等藍(lán)細(xì)菌的病毒，其基因組大小介于30～60 kb之間，直徑一般在0.6～30 m之間。Safferman和Morris分離出第一株噬藻體“LPP”，它能夠同時(shí)感染鞘絲藻（Lynbya）、席藻（Phormidium）和織線藻（Plevtonema）三種宿主。隨后陸續(xù)有噬藻體純株被分離，到目前為止，共有幾百種不同的噬藻體被分離純化，而海洋聚球藻病毒的研究開(kāi)始于1990年，之后很多聚球藻病毒被分離和研究。


新的海洋噬藻體的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步豐富了海洋噬藻體庫(kù)，并對(duì)進(jìn)一步研究宿主-噬藻體之間的相互作用關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在本研究中，為海洋噬藻體基因庫(kù)提供了新的基因組信息，并為維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及防止藻類污染提供了新的線索。


1材料與方法


1.1材料


使用液體侵染法（原海水）分離噬藻體。


用于分離噬藻體S-H35的海水樣品是采自中國(guó)北黃海海域H35站位（32？0N，122？2‘E）表層海水，采水量為1L。將水樣經(jīng)0.22 m的濾膜過(guò)濾兩次，除去微微型生物及細(xì)菌，得到用于分離噬藻體的原海水；若病毒含量較低，用中型切向流將過(guò)濾后的海水濃縮100-1000倍，得到濃縮水樣，置于4℃黑暗條件下保存待用。


1.2實(shí)驗(yàn)方法


1.2.1噬藻體的分離純化


將原海水與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的聚球藻按照體積比1：9的比例混勻，置于25癈，1000 lux光照條件的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周左右可以觀察到裂解現(xiàn)象。用雙層平板法對(duì)噬藻體進(jìn)行純化，重復(fù)3次純化實(shí)驗(yàn)，得到純凈噬藻體。


1.2.2噬藻體基因組的提取


液體侵染法富集病毒，用PEG濃縮法濃縮純化病毒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究（PEG濃縮病毒的方法參照Colombet等并加以改良）。


噬藻體基因組的提取方法具體參照Verheust等并加以改良。


1.2.3噬藻體的電鏡觀察


測(cè)定噬藻體的效價(jià)，當(dāng)效價(jià)大于1010PFU/ml時(shí)，用移液器量取20 L的噬藻體樣品加到銅網(wǎng)上，置于室溫下15 min，加一滴2%的磷鎢酸，染色10 min用于電鏡觀察。


1.2.4噬藻體的一步生長(zhǎng)曲線


（1）將噬藻體與其宿主按照0.01的比例混合均勻。


（2）將加入噬藻體的聚球藻置于25℃，1000 lux持續(xù)光照的環(huán)境中培養(yǎng)，加入后即開(kāi)始計(jì)時(shí)。


（3）在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)分別取樣，并用25%的戊二醛進(jìn)行固定。每個(gè)樣品都設(shè)置三個(gè)平行樣，分別測(cè)定后采用平均值。


（4）用微生物生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定噬藻體的具體數(shù)值，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以感染體系中的噬藻體不同時(shí)間的濃度為縱坐標(biāo)，繪制噬藻體的生長(zhǎng)曲線，通過(guò)計(jì)算得出噬藻體的潛伏期、裂解期和裂解量。


1.2.5噬藻體的宿主專一性鑒定


用JYS Red、TB、RCC2673、RCC753、RCC556、RCC2535、RCC307、TE4、CCMP1333、SW、WH8109、TB3 winter、TB2 winter、TB1 winter、KSHK01C、Prasce syn、YOKATA BAY、b3、WH7803、WH8102、MW01、MW02、MW03、LTW Red1、LTW Red2、MW15、SC7、b23、LTW Green、PSHK05、KSHK03、PSHK01、KSHK05共33株聚球藻進(jìn)行宿主專一性鑒定。


1.2.6噬藻體的基因組測(cè)序


對(duì)濃縮純化后的噬藻體高通量測(cè)序得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced Reads），對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，去除包含Adapter的序列及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到的Clean Data用于后續(xù)分析。采用雙端測(cè)序的方法，對(duì)基因組樣品進(jìn)行污染檢測(cè)后進(jìn)行基因組拼接，采用SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接，得到原始Scaffold。基因組注釋使用進(jìn)行編碼基因的預(yù)測(cè)，所采用的軟件是GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/）。

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