2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1噬菌體形態(tài)特征
以溶藻弧菌V039為宿主，采用點(diǎn)斑法篩選得到噬菌體φV039C(見圖1a)，經(jīng)純化后得到的噬菌斑清晰，直徑在1 mm左右，呈現(xiàn)出透明、無(wú)暈圈的形態(tài)(見圖1b)。通過電鏡觀察(見圖1c)，該噬菌體的頭部結(jié)構(gòu)是正廿面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑(58.9±2.9)nm，尾長(zhǎng)(105.2±5.7)nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第九次報(bào)告的病毒分類系統(tǒng)，噬菌體φV039C在分類上可能屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。
2.2噬菌體基因組酶切結(jié)果
酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果(見圖2)顯示：噬菌體φV039C的基因組能被DNase I降解，但不能被RNase A降解，說明其基因組類型是DNA；電泳結(jié)果也表明其基因組上有EcoR V、HindⅢ和EcoR I的酶切位點(diǎn)，但沒有BamH I酶切位點(diǎn)。因此，噬菌體φV039C基因組類型屬于dsDNA。
2.3噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)
按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)混合噬菌體和宿主菌液培養(yǎng)8 h之后，用雙層板測(cè)定各個(gè)MOI的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表1)表明，當(dāng)噬菌體與宿主比值為0.1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，能夠達(dá)到3.34×1010pfu/mL，因此噬菌體φV039C的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。
表1不同感染復(fù)數(shù)下噬菌體φV039C的效價(jià)
2.4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線
由噬菌體φV039C的一步生長(zhǎng)曲線(見圖3)可得出，噬菌體與宿主菌混合培養(yǎng)20 min，效價(jià)無(wú)明顯變化，因此噬菌體φV039C的潛伏期為20 min；20—30 min噬菌體效價(jià)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；30 min后噬菌體效價(jià)穩(wěn)定。由此得，噬菌體爆發(fā)期為培養(yǎng)后10 min。噬菌體裂解量=爆發(fā)期末期噬菌體密度/初始受感染宿主菌密度=(5.06×107)/(3.10×105)=163 pfu/cell。
2.5噬菌體全基因組分析
第三代單分子測(cè)序平臺(tái)測(cè)序結(jié)果表明，噬菌體φV039C的基因組(GenBank登錄號(hào)MN956515)為環(huán)形雙鏈DNA，全長(zhǎng)為43 405 bp，G+C含量為42.95%(見圖4)。共注釋得到77個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)。其中，已知功能閱讀框有17個(gè)，假想蛋白有20個(gè)，未注釋出的閱讀框有40個(gè)。核酸序列長(zhǎng)度在213～2436 bp，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度在71～812。所有ORF共含有40 870 bp的堿基，基因組的基因密度為94.20%。
用NCBI網(wǎng)站的blastn(megablast)程序進(jìn)行噬菌體φV039C的基因序列比對(duì)，在得到的同源序列中，噬菌體φV039C與溶藻弧菌噬菌體NF(MN812722)、副溶血弧菌噬菌體Seahorse(MN512538)的比對(duì)覆蓋率最高，同為11%，一致性分別為92.2%和93.3%，即從基因組來看，噬菌體φV039C與這二者最為接近。二者在分類上均屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體φV039C與溶藻弧菌噬菌體PVA1(KJ395778)的覆蓋率次之，為2%，其余檢索結(jié)果覆蓋率僅為1%。使用Mauve軟件對(duì)3個(gè)基因組進(jìn)行共線性比對(duì)分析(見圖5)，發(fā)現(xiàn)三者相互之間存在5個(gè)同源片段，但位置、順序不同，相似性也不高。
由全基因組的比對(duì)結(jié)果可見，噬菌體φV039C與現(xiàn)有NCBI登錄的其他噬菌體基因組相似區(qū)的比例很低，是一株新型的溶藻弧菌噬菌體。
2.6噬菌體φV039C功能性O(shè)RF的分析
對(duì)噬菌體φV039C的基因組進(jìn)行ORF注釋，共注釋出74個(gè)ORF(見表2)。
表2噬菌體φV039C的開放閱讀框注釋表
表2中的ORF1(重組酶)、ORF3(單鏈DNA結(jié)合蛋白)、ORF49(連接內(nèi)脫氧核糖核酸酶)、ORF57(DNA結(jié)合蛋白)、ORF58(轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)、ORF65(DNA螺旋酶)、ORF66(DNA結(jié)合蛋白)與噬菌體DNA復(fù)制有關(guān)；ORF6(N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶)為裂解酶，屬于噬菌體的裂解系統(tǒng)；ORF25(孔道蛋白)、ORF28(次要衣殼蛋白)、ORF29(主要衣殼蛋白)、ORF39(尾部裝配子)等屬于噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白。
2.7噬菌體φV039C比較基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
為探究噬菌體φV039C與其他噬菌體的進(jìn)化關(guān)系，選擇N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亞基終止酶(ORF19)兩種蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。從基于N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，φV039C與副溶血弧菌噬菌體Seahorse、溶藻弧菌噬菌體NF有著較近的親緣關(guān)系(見圖6)，這與全基因組的blast結(jié)果相近。而從基于大亞基終止酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，噬菌體φV039C與燦爛弧菌噬菌體1.144.0._10N.286.45.B3在同一分支上(見圖7)，后者在分類上也同樣屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。綜上所述，噬菌體φV039C在分類上應(yīng)歸屬有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科。
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