2結(jié)果與分析
2.1不同濃度二氧化氯對果膠桿菌生長曲線的影響
生長曲線是反映微生物總量隨時間變化的過程，可以看出微生物對培養(yǎng)基適應(yīng)的快慢程度以及對培養(yǎng)基成分的利用情況。如圖1所示，二氧化氯對果膠桿菌的生長有明顯抑制作用，且隨著二氧化氯濃度的升高，抑制效果明顯加強。在培養(yǎng)14h后，0.75 mgL、1.0mgL組的生長曲線趨于穩(wěn)定，0.25mgL、0.5mgL組的生長曲線雖然有小幅度的上升，但與對照組差異顯著(P<0.05)。在培養(yǎng)20h后，0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL的二氧化氯對果膠桿菌的抑制率分別為17.9%、26.4%、45.9%、66.6%，其中1.0mgL組的抑制效果最佳。
2.2不同濃度二氧化氯對果膠桿菌存活率的影響
細菌的存活率能夠反映外界環(huán)境條件對活細菌比例影響。如圖2所示，隨著二氧化氯濃度的升高果膠桿菌的存活率逐漸降低，且各處理組之間差異性顯著(P<0.05)，說明二氧化氯對果膠桿菌有致死作用。1.0mgL組的細菌存活率只有對照組的17.18%。
圖1不同二氧化氯濃度對果膠桿菌生長的影響
注：不同小寫字母表示經(jīng)Duncan差異顯著性檢測不同處理組在0.05水平差異顯著(n=10)，下同圖2不同二氧化氯濃度對果膠桿菌存活率的影響
圖3不同二氧化氯濃度對細胞膜滲透率的影響
2.3不同濃度二氧化氯對果膠桿菌細胞膜滲透率的影響
如圖3所示，不同濃度的二氧化氯溶液對果膠桿菌細胞膜滲透性的破壞程度不同。隨著處理時間的延長，各組的細胞膜滲透率均呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢。細菌細胞膜滲透率的變化主要在前30min，之后，對照組、0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL處理組的細菌細胞膜滲透率趨于穩(wěn)定，而1.0mgL處理組的細胞膜滲透率繼續(xù)增加，于120min后趨于穩(wěn)定。表明高濃度的二氧化氯處理能夠作用于果膠桿菌的細胞膜，破壞其選擇滲透性，影響細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，從而抑制細菌的生長繁殖。
2.4不同濃度二氧化氯對果膠桿菌果膠酶活性的影響
果膠酶是指分解果膠的一種多酶復(fù)合物，腐敗菌通過分泌PG破壞寄主的細胞壁結(jié)構(gòu)，使其能夠吸收寄主的營養(yǎng)寄生。如圖4所示，在培養(yǎng)過程中，PG活性呈現(xiàn)先迅速升高后趨向平穩(wěn)，最后下降的趨勢。3d時，各組的PG活性達到峰值，對照組最大，為21.5 U，而0.25 mgL、0.5 mgL、0.75 mgL和1.00 mgL組的果膠酶活性分別為19.3 U、16.4 U、14.9 U和9.7 U，說明二氧化氯處理能夠顯著抑制果膠桿菌產(chǎn)生的PG活性。
聚甲半乳糖醛酸酶是屬于果膠酶系的一種能夠催化果膠分子多聚α-(1,4)-聚甲半乳糖醛酸的裂解酶。在果膠桿菌的致病過程中可以起到分解寄主表皮細胞中果膠的作用，如圖5所示，PMG活性曲線與PG曲線趨勢相似，均在第3天達到峰值，且各個二氧化氯處理組的PMG活性顯著(P<0.05)低于對照組，僅為對照組的88.7%、76.7%、61%和32.6%。
培養(yǎng)后期，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，PG、PMG活性迅速下降。
2.5不同濃度二氧化氯對果膠桿菌纖維素酶活性的影響
聚甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶都是纖維素酶系中的一種，能夠降解纖維素，是植物病原菌所分泌的重要致病因子，在植物的致病過程中分解植物表皮細胞的纖維素，引起細胞壁損傷以及組織浸解。如圖6所示，在整個培養(yǎng)期間，CX活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值在第4天，晚于PG、PMG，且活性較低，1 mgL二氧化氯組的CX活性僅為對照組的30.4%。之后，隨著二氧化氯濃度的升高，酶活性顯著(P<0.05)降低，說明二氧化氯能夠有效抑制CX活性，且與濃度呈正相關(guān)。
如圖7所示，GLU活性的變化趨勢與CX相同，均在第4天達到峰值，其中對照組的GLU活性為0.77U，0.25 mgL、0.50 mgL、0.75 mgL、1.00 mgL組的GLU活性分別為0.63 U、0.55 U、0.46 U、0.21 U。之后，隨著二氧化氯濃度的升高降低，說明二氧化氯處理能夠抑制GLU活性，其中1.00 mgL處理組的抑制效果最佳。
2.6不同濃度二氧化氯對果膠桿菌致病力的影響
杭白菜的發(fā)病率是衡量果膠桿菌致病力強弱的主要指標。從二氧化氯氣體處理杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑和發(fā)病率情況可以看出，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL均能抑制杭白菜軟腐病的發(fā)生，對照組處理的杭白菜在接種20 h后，其莖段病情指數(shù)達到100%，病斑直徑為25.3 mm，到第38小時其病斑直徑為49.7 mm，而此時，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL處理組的病斑直徑分別為40.7 mm、28.7 mm、18.3 mm，與對照組差異顯著(P<0.05)(表2)，說明二氧化氯氣體對果膠桿菌的抑制作用隨著濃度的升高逐漸增大。接種后38 h發(fā)病情況如圖8所示，0.14 mgL、0.57 mgL處理組病情指數(shù)分別為80.0%、65.0%；1.00 mgL處理組杭白菜莖段在接種后14 h開始發(fā)病，在第38小時其病情指數(shù)為55.0%，說明二氧化氯氣體處理對果膠桿菌的抑制效果與其濃度呈正相關(guān)。
圖8第38小時不同處理組杭白菜的病情指數(shù)
3結(jié)論與討論
二氧化氯作為一種新型廣譜、高效、環(huán)保的殺菌劑，近些年已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品抑菌防腐保鮮行業(yè)。其應(yīng)用于殺菌的機理主要是其具有強氧化性，可以穿透細胞膜，破壞細菌細胞膜的通透性從而破壞細菌細胞的物質(zhì)交換，導(dǎo)致細菌生長繁殖受到抑制。Wang等用二氧化氯處理蠶微孢子蟲孢子后，蛋白質(zhì)、多糖、鉀離子、鈣離子從細胞中漏出，導(dǎo)致孢子因細胞膜透性增加，失去活性。二氧化氯液體處理組中，1.00 mgL處理組的浸提液中可溶性蛋白的含量0.93 mgg，說明二氧化氯氣體處理可以破壞果膠桿菌細胞膜的滲透性，使細胞內(nèi)可溶性蛋白滲出，影響細菌細胞正常生理功能，從而抑制果膠桿菌的生長。微生物生長曲線可以直觀地顯示其生長規(guī)律，反應(yīng)微生物對環(huán)境的適應(yīng)程度以及對培養(yǎng)基成分的利用情況。本研究加入二氧化氯溶液后，細菌的生長速度明顯下降，且隨著濃度的增大，抑制效果愈明顯。Boddie等利用二氧化氯處理牛乳，可以減少其中80%—90%的奧利斯葡萄狀球菌和鏈球菌，在牛初乳中加入0.5%的二氧化氯溶液，可三個月不霉變，延長貯藏期。本試驗中，1.00mgL二氧化氯處理果膠桿菌后，其存活率降低為17.18%，說明二氧化氯具有使用劑量低且高效的優(yōu)勢，與前人的研究結(jié)果一致。
果膠桿菌是白菜類蔬菜軟腐病的主要致病菌，其寄主范圍廣泛，侵染能力較強。目前對于果膠桿菌的致病機理國內(nèi)外都有研究，果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過程中起著關(guān)鍵作用，可以破壞植物的細胞壁結(jié)構(gòu)，分解利用植物細胞和組織內(nèi)營養(yǎng)成分，引起細胞死亡。田紅炎等等使用60 mgL二氧化氯溶液浸泡處理受損后獼猴桃20 min，可以顯著降低其腐爛指數(shù)。本研究將果膠桿菌菌懸液接種于損傷杭白菜莖段，發(fā)現(xiàn)杭白菜軟腐病的發(fā)病情況與前人研究一致，首先，損傷組織被侵染發(fā)病，隨后病斑不斷擴大，導(dǎo)致組織水浸腐敗。試驗結(jié)果顯示，二氧化氯氣體處理對杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑的擴展以及發(fā)病率有一定的抑制作用，經(jīng)二氧化氯氣體處理后的果膠桿菌，其病斑擴展速度比對照組擴展速度慢；1.00 mgL二氧化氯氣體濃度以上的處理組，接種14 h后發(fā)病，從果膠桿菌接種到發(fā)病的時間顯著延長，說明二氧化氯氣體處理對果膠桿菌的致病力有一定的抑制作用。Kan研究指出，細胞壁降解酶可以降解細胞壁多糖，破壞細胞壁，使原生質(zhì)體失去原有的支持力，引起細胞膜變形破裂，使寄主死亡。本研究發(fā)現(xiàn)二氧化氯可以抑制果膠酶系、纖維素酶系等細胞壁降解酶的活性，從而降低了果膠桿菌的致病性，說明二氧化氯在抑制果膠桿菌的致病性方面有很好的效果。
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