傳統(tǒng)的細菌治療在癌癥治療中面臨著安全性和有效性之間的平衡問題。雖然一些細菌，如沙門氏菌，因其能夠在腫瘤微環(huán)境中選擇性增殖而被研究用于癌癥治療，但它們作為異源微生物，可能會引發(fā)宿主的免疫反應，導致治療效果受限。此外如何確保細菌在腫瘤組織中的有效富集，同時減少對正常組織的損害，也是一大挑戰(zhàn)。研究者們采用了液氮冷凍休克技術(shù)處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細胞。這種方法能夠在不破壞細胞結(jié)構(gòu)的前提下，使巨噬細胞失去活性，同時保持內(nèi)部細菌的活性。通過這種方式，細菌被有效地偽裝在巨噬細胞內(nèi)部，從而在避免初始免疫清除的同時，能夠被運輸?shù)侥[瘤組織中。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過冷凍休克處理的巨噬細胞（LNT MACS/VNP）能夠在腫瘤組織中實現(xiàn)細菌的有效富集。這種偽裝策略減少了細菌被循環(huán)系統(tǒng)中的中性粒細胞清除的風險，并且由于巨噬細胞的自然趨向性，增強了細菌在腫瘤中的積累。此外這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應，包括增加抗腫瘤效應細胞的數(shù)量和減少免疫抑制細胞的數(shù)量。
本研究提供了一種新的策略，通過利用巨噬細胞作為載體，將減毒細菌有效地輸送到腫瘤組織中，同時激活抗腫瘤免疫反應。這種方法不僅提高了治療效果，而且減少了傳統(tǒng)細菌治療可能引起的副作用，為癌癥治療提供了新的可能性。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
用于實時監(jiān)測不同條件下細菌（如減毒沙門氏菌VNP20009及其變體）在LB培養(yǎng)基中的生長情況。使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀監(jiān)測不同菌株在LB培養(yǎng)基中的生長條件。在兩次傳代培養(yǎng)后激活的VNP菌株被調(diào)整至OD600為1.0。然后，將10μL細菌懸浮液添加到1mL LB培養(yǎng)基中。充分混合后，將300μL溶液添加至Bioscreen C微孔板的孔中。將微孔板在37°C下孵育30小時，以30分鐘的間隔進行連續(xù)OD600測量。通過連續(xù)測量培養(yǎng)液的吸光度（OD600），可以獲取細菌生長曲線，從而評估細菌的生長速率和生長階段。
實驗結(jié)果
通過液氮冷凍休克處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細胞株，制備出“死亡”但“功能性”的沙門氏菌加載巨噬細胞。這些處理后的巨噬細胞保持了完整的細胞結(jié)構(gòu)，失去了原有的致病性，而內(nèi)部的細菌保留了原有的生物活性，并能在體內(nèi)延遲釋放和增殖。這種“特洛伊木馬”策略有效避免了細菌免疫原性引起的中性粒細胞招募和激活，減少了細菌被中性粒細胞清除，增強了細菌在腫瘤中的富集效率。此外，這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境，提高了抗腫瘤效應細胞（包括M1型巨噬細胞和CD8+Teffs）的數(shù)量，減少了促腫瘤效應細胞（包括M2型巨噬細胞和CD4+Tregs）的數(shù)量，并最終在皮下H22荷瘤小鼠模型中提高了抗腫瘤效果。
圖1、裝載VNP菌株的冷凍休克巨噬細胞的制備和表征。a)LNT MACS/VNP細胞制備過程示意圖。b)與VNP菌株（MACS+VNP）共培養(yǎng)的巨噬細胞（MACS）的明場圖片。赫斯特標記細胞核（藍色）。紅色箭頭表示VNP菌株。比例尺=10μm。c)隨著細胞與菌株共培養(yǎng)的時間，MACS中細胞內(nèi)加載的活VNP菌株的數(shù)量以及形態(tài)完整的MACS的百分比發(fā)生變化（n=5）。d)Live MACS、Live MACS/VNP細胞和LNT MACS/VNP細胞的熒光圖像。FITC-鬼筆環(huán)肽標記肌動蛋白（綠色）；DAPI標記細胞核（藍色）。紅色箭頭表示細胞內(nèi)VNP-RFP菌株。比例尺=20μm。e)活MACS/VNP和LNT MACS/VNP細胞的明場圖片。赫斯特標記細胞核（藍色）。白色箭頭表示VNP菌株（表達紅色熒光蛋白的菌株）。比例尺=5μm。f)使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同細胞的形態(tài)。比例尺=5μm。g)顯示了LNT MACS和LNT MACS/VNP-RFP的相對平均熒光強度(MFI)。au，任意單位。h)Live MACS和LNT MACS增殖活性比較示意圖。i)Live MACS和LNT MACS的體內(nèi)增殖活性比較（右）。百分比值總結(jié)自三個獨立實驗（每個獨立實驗每組n=5只小鼠）。顯示了質(zhì)量生成的代表性解剖學觀察圖像（左）。
圖2、胞內(nèi)VNP菌株可由LNT MACS/VNP細胞釋放并保持其原有的生物活性。a，，活MACS/VNP和LNT MACS/VNP細胞的細胞內(nèi)活株數(shù)量的變化（左）（n=5）。顯示了代表性的涂層板（右）。b，液氮冷處理12小時后VNP菌株的存活率（n=5）。冷凍休克處理前后應變活性變化示意圖（右）。c，使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察不同細胞的形態(tài)。紅色箭頭表示細胞內(nèi)菌株。比例尺=5μm（正常視野）和1μm（放大視野）。d，實時監(jiān)測Live MACS/VNP-RFP和LNT MACS/VNP-RFP細胞培養(yǎng)板的RFP熒光強度變化（n=3）。e，使用VNP-pSifB-RFP（紅色熒光蛋白，RFP）通過MACS檢查細菌釋放的示意圖（左）。由于pSifB啟動子，VNP-pSifB-RFP菌株僅在細胞內(nèi)被激活并表達RFP。MACS或LB培養(yǎng)基中VNP-psifB-RFP菌株的熒光場圖片（右）。激活的VNP-psifB-RFP菌株（紅色）；沙門氏菌特異性抗體標記VNP（綠色）；DAPI標記細胞核（藍色）。比例尺=5μm。f，從LNT MACS/VNP-pSifB-RFP細胞釋放細胞內(nèi)VNP-pSifB-RFP菌株的明場圖片（左）。赫斯特標記細胞核（藍色）。橙色箭頭表示細胞內(nèi)菌株，紅色箭頭表示細胞外菌株。將細胞培養(yǎng)在補充有痕量慶大霉素的培養(yǎng)基中。比例尺=20μm。從三個液氮處理時間組（處理后6/12/24小時）的不同時間點隨機選擇5個視野來計數(shù)胞外表達RFP的細菌（右）。g，借助TEM觀察LNT MACS/VNP細胞中細胞內(nèi)VNP菌株的釋放（左）。白色曲線顯示應變從細胞內(nèi)到細胞外的運動。橙色箭頭表示LNT MACS細胞表面的凹口，這可能是由細胞內(nèi)應變運動引起的。藍色箭頭表示細胞外增殖的細菌。比例尺=1μm（正常視野）和500 nm（放大視野）。細胞內(nèi)應變釋放示意圖（右）。h，正常VNP和LNT MACS釋放的VNP在37°C LB液體培養(yǎng)基中的細菌形態(tài)（頂部）和生長曲線（底部）（n=3）。i使用3.0μm Transwell小室間接共培養(yǎng)LNT MACS/VNP細胞與H22腫瘤細胞的示意圖。細菌可以穿過這種孔徑的室。j(i)中H22腫瘤細胞共培養(yǎng)不同時間后的相對平均熒光強度(MFI)比較。k H22細胞以100 MOI的不同VNP感染1小時，并通過將細胞裂解物鋪在LB固體板上來確定內(nèi)化VNP的數(shù)量(n=5)。l H22細胞與不同菌株以MOI為100孵育4小時后，對Annexin V和碘化丙啶（PI）染色進行代表性FACS分析，凋亡細胞（Annexin V+細胞）百分比的定量分析顯示在右邊（n=4）。m不同菌株與M0型巨噬細胞共培養(yǎng)6小時后，通過實時PCR檢測抗腫瘤M1型巨噬細胞相關(guān)基因的表達水平。n與LNT VNP、LNT MACS或LNT MACS/VNP孵育或不孵育后H22腫瘤細胞的增殖。細胞核染料Hoechst用于檢測細胞數(shù)量的變化。
圖3、LNT MACS保護VNP菌株免遭清除并促進其在腫瘤中的積累。a LNT MACS/VNP細胞偽裝胞內(nèi)菌株以逃避中性粒細胞介導的細菌清除的示意圖。b原代腹膜中性粒細胞與LNT MACS+VNP和LNT MACS/VNP共培養(yǎng)不同時間后培養(yǎng)基中活菌株百分比的變化。c、d比較（b）中不同處理后60分鐘培養(yǎng)基中中性粒細胞產(chǎn)生的NET和ROS水平。e不同處理后1小時外周血中性粒細胞總數(shù)中活化中性粒細胞（CD11b高CD62L低）百分比變化的代表性流式細胞圖（上）和條形比較圖（下）（n=5）。f通過共聚焦顯微鏡分析Live MACS、Live MACS/VNP和LNT MACS/VNP細胞中的CD11b和CCR2表達。白色箭頭表示細胞內(nèi)菌株。比例尺=10μm。g不同細胞中CD11b和CCR2的代表性流式細胞術(shù)。h顯示指定組腫瘤的熒光和生物發(fā)光強度（n=5）。使用DiR標記的細胞和VNP-LuxCDABE菌株。i(h)中不同處理后8小時分離的腫瘤的熒光圖像。j注射后時間與腫瘤內(nèi)細菌數(shù)量之間的關(guān)系（n=4或5）。k根據(jù)第6天提取的器官回收的CFU計算每克細菌CFU的腫瘤與肝臟比率(n=5)
圖4、LNT MACS/VNP可降低菌株誘導的生物毒性。a H22荷瘤小鼠不同組別(G0-G4)的安全性評估、腫瘤靶向和治療試驗示意圖。b給藥1天后各組小鼠肝臟炎癥病變的代表性圖片。黑色箭頭表示病理性肝臟病變的部位。比例尺=10毫米。c(b)中各組肝臟炎癥病變點數(shù)比較的條形圖（n=5）。d代表性H&E染色的特寫視圖，顯示治療后1天的肝損傷（黑色箭頭）。比例尺=40μm。e隨機選擇(d)中的5個視野來計算病變面積。f不同治療后1天的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平（n=4或5）。g不同治療后1天體重變化（n=9或18）。h細菌刺激免疫細胞產(chǎn)生炎癥因子的示意圖。i不同治療后1天（n=5或6）H22荷瘤小鼠外周血中IL-6（上）和IL-10（下）濃度的檢測。j不同治療后1天外周血CD4+T細胞中Tregs（CD25+CD127 Low細胞）百分比的變化。顯示了代表性的流式細胞術(shù)圖（n=5）。k心臟、腎、肺和脾切片代表性H&E染色的特寫視圖（比例尺=40μm）。
圖5、LNT MACS/VNP細胞有效抑制H22腫瘤生長。a H22荷瘤小鼠不同組別(G0-G4)的安全性評估、腫瘤靶向和治療試驗示意圖。b不同治療后的腫瘤生長情況（n=7）。c(b)中每只小鼠的腫瘤生長曲線。(b)中給藥后12天對腫瘤進行拍照(d)并稱重(e)。比例尺=10毫米。f(b)中不同組腫瘤體積倍增時間的比較。g腫瘤的代表性H&E染色圖像（左），隨機選擇5個視野來計算壞死區(qū)域的面積（右）。黑色箭頭表示壞死區(qū)域。比例尺=100μm。h按(a)中所述處理的小鼠的存活曲線。當小鼠達到人道終點時，它們被殺死。
總結(jié)
本研究開發(fā)了一種新型的腫瘤靶向治療方法，通過冷凍休克巨噬細胞來偽裝減毒沙門氏菌，用于癌癥的免疫治療。由于細菌治療的安全性和有效性難以平衡，限制了其在臨床應用的推廣。本研究通過液氮冷凍休克處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細胞株，制備出“死亡”但“功能性”的沙門氏菌加載巨噬細胞。這些處理后的巨噬細胞保持了完整的細胞結(jié)構(gòu)，失去了原有的致病性，而內(nèi)部的細菌保留了原有的生物活性，并能在體內(nèi)延遲釋放和增殖。這種“特洛伊木馬”策略有效避免了細菌免疫原性引起的中性粒細胞招募和激活，減少了細菌被中性粒細胞清除，增強了細菌在腫瘤中的富集效率。Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于實時監(jiān)測不同條件下細菌（如減毒沙門氏菌VNP20009及其變體）在LB培養(yǎng)基中的生長情況，通過Bioscreen C收集的數(shù)據(jù)，研究者能夠比較正常培養(yǎng)條件下的VNP細菌和從冷凍休克巨噬細胞中釋放的VNP細菌的生長特性，包括生長速率和生長至穩(wěn)定期的時間，并確定最佳的細菌培養(yǎng)條件，如溫度、pH值和培養(yǎng)基成分，以確保細菌在實驗中的穩(wěn)定性和活性。幫助研究者詳細分析了細菌的生長特性，這對于評估冷凍休克巨噬細胞偽裝減毒沙門氏菌策略的有效性至關(guān)重要。通過這些數(shù)據(jù)，研究者能夠優(yōu)化治療方案，并為進一步的體內(nèi)外研究提供了重要的基礎(chǔ)信息。此外這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境，提高了抗腫瘤效應細胞（包括M1型巨噬細胞和CD8+Teffs）的數(shù)量，減少了促腫瘤效應細胞（包括M2型巨噬細胞和CD4+Tregs）的數(shù)量，并最終在皮下H22荷瘤小鼠模型中提高了抗腫瘤效果。液氮冷凍休克巨噬細胞介導的細菌輸送策略有望擴展活菌治療癌癥的治療應用。
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