稻曲病由稻曲病菌（Villosiclava virens，無性態(tài)為Ustilaginoidea virens）引發(fā)。稻曲病菌為肉座菌目、麥角菌科、綠核菌屬真菌。該菌在水稻孕穗早期侵染水稻幼穗，從花絲頂部侵入，然后朝花絲基部擴展，在籽粒灌漿中后期形成稻曲球。稻曲球表面可產(chǎn)生大量厚垣孢子，還可形成若干菌核。稻曲病菌侵染水稻后會吸收寄主的營養(yǎng)物質(zhì)用于自身生長發(fā)育，從而導致稻谷空粒，造成水稻減產(chǎn)。此外，稻曲球還含有對人、動物和植物均有一定毒性的毒素，嚴重影響稻米品質(zhì)。
由于大面積推廣種植的水稻品種缺乏抗性以及氣候變化等原因，近年來，稻曲病的發(fā)生呈現(xiàn)不斷加重的趨勢。該病已由一種零星、偶發(fā)性病害逐漸發(fā)展成為一種水稻主要病害。在我國，此病在東北、西南和長江中下游稻區(qū)危害較重，主要發(fā)生于晚稻上。在其他亞洲國家或地區(qū)，以及美洲和非洲，亦有此病大面積發(fā)生的報道。
稻曲病菌雖然屬于活體營養(yǎng)型病原真菌，但不能進入寄主細胞內(nèi)部，不能產(chǎn)生吸器類結(jié)構(gòu)，侵染模式為典型的細胞外侵染和擴展，其向水稻深層組織的擴展由菌絲完成。目前關于稻曲病菌菌絲生長調(diào)控的研究仍非常薄弱，對該菌菌絲的生長受到哪些因子調(diào)控及涉及的調(diào)控機制了解不多，導致研究者對該菌在水稻深層組織中擴展的調(diào)控機制不甚明確。
研究已證實照光可影響一些真菌的生長發(fā)育，但關于照光對稻曲病菌的影響尚存在爭議。有研究報道，稻曲病菌菌核在黑暗中萌發(fā)的菌絲只產(chǎn)生分生孢子；而在充分照光條件下萌發(fā)的菌絲可形成子實體，產(chǎn)生子囊孢子，表明照光對該菌的生殖過程有重要影響。然而，液體培養(yǎng)菌絲的產(chǎn)孢過程不受照光影響，不管照光與否都只產(chǎn)分生孢子，且孢子產(chǎn)量無差異。照光被報道可誘導固體培養(yǎng)菌絲產(chǎn)生厚垣孢子，而黑暗條件下基本不產(chǎn)孢；另有研究給出了相反結(jié)論，即黑暗條件下可產(chǎn)生大量厚垣孢子，而照光條件下不產(chǎn)孢。對于稻曲病菌菌絲，有研究報道照光可抑制其生長，也有文獻則報道照光對其無影響。上述研究結(jié)論的諸多不一致表明，關于照光對稻曲病菌生長發(fā)育的影響尚待開展更多、更細致的研究予以明確。
鑒于此，本研究比較了照光和黑暗條件下稻曲病菌菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，并應用轉(zhuǎn)錄組測序技術，比較了上述2組菌絲的基因整體表達情況，分析了照光引起的差異表達基因。本研究的結(jié)果有助于明確照光對稻曲病菌菌絲生長的影響，增進人們對該菌菌絲生長調(diào)控機制的認識，為水稻生產(chǎn)中科學、高效地防控稻曲病奠定理論基礎。
1材料與方法
1.1試驗菌株與培養(yǎng)方法
試驗材料為稻曲病菌ZJ09菌株，從田間水稻病株上采集稻曲球并進行多代單菌落分離純化后得到。
菌株培養(yǎng)方法：取馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato sucrose agar,PSA）培養(yǎng)基平板上正常生長15 d的稻曲病菌，用直徑為5 mm的打孔器沿著菌落邊緣打取菌碟，接種于新的PSA平板中央，分成黑暗組與照光組2組，黑暗組培養(yǎng)于保持黑暗條件的培養(yǎng)箱中，照光組培養(yǎng)于用日光燈提供白光（光照強度為4 000 lx）的培養(yǎng)箱中，溫度均為28℃。分別于培養(yǎng)7、15、20 d后取培養(yǎng)物用顯微鏡觀察和拍照，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個時間點每組均觀測6皿。凡用于測量菌落直徑的PSA平板在測量完后均終止培養(yǎng)。用鐵勺分別從培養(yǎng)20 d的黑暗組與照光組PSA平板上刮取菌絲，用錫箔紙包好，立即用液氮快速冷凍，隨后送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。在轉(zhuǎn)錄組試驗中，黑暗組與照光組均設2個重復，每個試驗重復至少含3皿PSA平板培養(yǎng)物，作為生物學重復。
1.2轉(zhuǎn)錄組試驗方法
1.2.1 cDNA文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序流程
采用Oligo（dT）磁珠法富集稻曲病菌菌絲樣本總RNA中帶有多聚A（poly A）的mRNA，再加入二價金屬離子溶液，將其打斷成長200～300堿基的片段。繼而用6堿基隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈，以第1鏈cDNA為模板合成第2鏈，第2鏈的cDNA的堿基T被替換為堿基U，獲得鏈特異性文庫。文庫構(gòu)建完畢后，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增進行片段富集，再根據(jù)片段大小（300～400 bp）進行選擇。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對得到的文庫進行質(zhì)檢，檢測文庫的總濃度及有效濃度。根據(jù)文庫有效濃度及所需數(shù)據(jù)量，將含有不同Index序列的文庫按比例混合，統(tǒng)一稀釋至2 nmol/L。最后，采用第2代測序技術（next-generation sequencing），基于Illumina HiSeq測序平臺，對所得文庫進行雙末端測序。
1.2.2轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析
上述得到的文庫經(jīng)上機測序，得到圖像文件，再由測序平臺自帶軟件進行轉(zhuǎn)化，獲得FASTQ格式的原始下機數(shù)據(jù)（raw data），統(tǒng)計每個樣品的堿基識別準確率。將原始數(shù)據(jù)采用Cutadapt進行過濾，去除3′端的接頭，獲得高質(zhì)量識別序列（clean data），使用Tophat軟件將其與稻曲病菌“UV-8b”參考基因組序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/31935?genome_assembly_id=59177）進行比對，默認識別序列（reads）和參考基因組序列的錯配個數(shù)在2個之內(nèi)，即為比對（mapping）成功。拼接比對成功的識別序列，還原出轉(zhuǎn)錄本序列。
對于使用Tophat軟件比對成功的序列，利用Cufflinks-2.2.1（http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks），通過計算每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per million base pairs sequenced,FPKM）來對基因表達進行定量；利用Cuffdiff分析模塊篩選差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），篩選標準為|log2（差異倍數(shù)）|＞1，且Q＜0.05，其中，差異倍數(shù)=照光組樣品基因表達量/黑暗組樣品基因表達量。
隨后，對篩選到的DEGs進行基因本體（gene ontology,GO）功能顯著性富集分析，把所有DEGs向GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org）的各個分類映射，計算每個分類的基因數(shù)目，得到DEGs顯著富集的GO類別（term）。
此外，利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）公共數(shù)據(jù)庫，使用軟件KOBAS 2.0對篩選到的DEGs進行KEGG通路（pathway）注釋，獲得通路顯著性富集結(jié)果。
1.3用實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
以稻曲病菌的α微管蛋白-1編碼基因作為內(nèi)參基因，選取6個表達豐度較高的DEGs，其中上調(diào)和下調(diào)的基因各3個（表1），進行RT-qPCR，以驗證本研究中轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的DEGs的可靠性。用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在線引物設計工具Primer-Blast來設計引物，引物序列見表1。用鐵勺從培養(yǎng)20 d的黑暗組與照光組PSA平板上分別刮取菌絲，用Trizol法提取總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒（日本東洋紡公司）進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。用SYBR Green QPCR主混料試劑盒（日本東洋紡公司）進行RT-qPCR，儀器為Mastercycler epgradient S型熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司）。PCR擴增體系（20μL）：SYBR Green定量PCR主混料10μL，10μmol/L上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH2O 6.4μL。PCR擴增程序：95℃預變性60 s；95℃變性10 s，60℃延伸30 s，40個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_量采用2－△△CT法計算。
表1實時熒光定量PCR試驗所用引物
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