2結(jié)果與分析
2.1窖泥中酯化菌富集方法的優(yōu)化
窖泥經(jīng)不同富集時間、不同富集次數(shù)富集后，采用HSSPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質(zhì)含量和種類數(shù)的變化，結(jié)果見圖1。
圖1富集時間（a）及富集次數(shù)（b）對富集液中酯類化合物含量和種類數(shù)的影響
由圖1a可知，隨著富集時間的延長，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)和含量均呈先增加后穩(wěn)定的變化趨勢。富集16 d時，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)達到11種，酯類物質(zhì)總含量達到199 mg/100 mL，均顯著高于富集前期（P＜0.05）。富集16 d后，隨著富集時間的延長，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)和含量均趨于穩(wěn)定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于富集16 d后目標菌群進入穩(wěn)定期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗及富集液中微生物代謝產(chǎn)物的積累，目標菌群生長受到抑制逐漸進入衰亡期。
由圖1b可知，隨著富集次數(shù)的增加，窖泥富集液中酯類物質(zhì)含量呈先上升后降低的變化趨勢，富集2次時，酯類化合物含量達到最大（280 mg/100 mL），顯著高于1次富集（P＜0.05）；而酯類物質(zhì)種類數(shù)隨富集次數(shù)增加呈下降變化，富集2次時酯類物質(zhì)種類數(shù)為8種，隨后趨于穩(wěn)定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于第一次富集液中產(chǎn)酯微生物種類豐富但生物量較少，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物酯類物質(zhì)種類數(shù)多而含量較少，隨著富集次數(shù)增加，富集液中微生物逐漸被馴化，部分微生物被淘汰，優(yōu)勢產(chǎn)酯微生物愈加的集中，使得富集液中的酯類物質(zhì)種類數(shù)趨于穩(wěn)定而含量升高。因此，窖泥富集液富集培養(yǎng)16 d，富集2次有利于酯化菌的富集。但為保證目標微生物的富集效果，略微延長富集時間，選擇富集時間為20 d。
2.2窖泥中酯化菌的分離與篩選
采用稀釋平板涂布法從優(yōu)化后的窖泥富集液中分離出23株菌，再通過HS-SPME-GC-MS檢測復(fù)篩出3株代謝生產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3。
2.3酯化菌的鑒定
2.3.1形態(tài)觀察
3株菌株的菌落、細胞形態(tài)及其革蘭氏染色結(jié)果見圖2。
圖2 3株菌株的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)
由圖2可知，3株菌皆為厭氧的革蘭氏陽性（G+）白色桿狀細菌。菌株Y1的菌落呈米白色、正反面顏色一致、邊緣規(guī)整、圓形、外觀形態(tài)小，細胞呈桿狀、有一定的排列方式，革蘭氏陽性，厭氧；菌株Y2的菌落呈灰白色、菌落中間顏色較淺、邊緣顏色較白、較光滑、比較濕潤、不易于挑取，細胞呈桿狀，G+，厭氧；菌株Y3的菌落呈黃白色、濕潤、光滑、不透明、外觀形態(tài)小、易于挑取，細胞呈桿狀，G+，厭氧。
2.3.2生理生化鑒定結(jié)果
3株菌株的生理生化試驗結(jié)果見表1。
表1 3株菌株的生理生化鑒定結(jié)果
由表1可知，菌株Y2水解淀粉結(jié)果為陰性，菌株Y3的接觸酶試驗結(jié)果呈陰性，除此之外，3株菌株的其他生理生化反應(yīng)試驗結(jié)果均呈陽性。結(jié)合形態(tài)觀察，初步鑒定菌株Y1、Y2、Y3均為厭氧梭菌屬（Clostridiumsp.）。
2.3.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果
菌株Y1～Y3純化后提取基因組DNA，以其為模板進行16S rDNA的擴增，采用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，結(jié)果見圖3。
圖3 3株菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
由圖3可知，3株菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的堿基長度為1 600 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，委托上海美吉公司進行測序。將測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。
圖4基于16S rDNA基因序列3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹
由圖4可知，菌株Y1與拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株Y2與Clostridium guangxiense聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株Y3與Clostridium sartagoforme聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗結(jié)果，鑒定菌株Y1、Y2、Y3分別為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、Clostridium guangxiense、Clostridium sartagoforme。有文獻報道，C.beijerinckii、C.guangxiense能發(fā)酵產(chǎn)丁醇，特別是C.beijerinckii能夠利用糖質(zhì)和木質(zhì)素水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇，在用生物法來生產(chǎn)丁醇中得到廣泛應(yīng)用；C.sartagoforme是一種纖維素（和幾丁質(zhì)）降解細菌。
3株酯化菌均為厭氧梭菌，這可能是由于梭菌在優(yōu)質(zhì)窖泥中已經(jīng)是優(yōu)勢微生物，經(jīng)過富集培養(yǎng)基多輪次富集，在富集液中占據(jù)主導(dǎo)地位，這也表明窖泥中的梭菌可能為濃香型白酒釀造中重要的酯化生香菌。因此，加強這3株菌的研究對提升白酒質(zhì)量具有重要意義。
2.4酯化菌培養(yǎng)條件試驗結(jié)果
2.4.1 3株菌株的生長曲線
為了解菌株Y1、Y2、Y3的生長情況，在厭氧條件下測定3株菌株的生長曲線，結(jié)果見圖5。
圖5 3株菌株厭氧條件下的生長曲線
由圖5可知，3株菌株的生長趨勢一致，生物量均呈先上升后穩(wěn)定再下降的變化趨勢，其中前24 h為延滯期；24～64 h為對數(shù)生長期；64～80 h為平穩(wěn)期；80 h后進入衰亡期。這可能是由于前24 h菌株正在適應(yīng)新的培養(yǎng)液環(huán)境，大量合成細胞分裂所需的酶類及其他細胞成分，細胞生長但不分裂，培養(yǎng)液中生物量不變；24 h后菌株已適應(yīng)新的生長環(huán)境，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)使它們快速生長繁殖；64 h后培養(yǎng)液中的大部分營養(yǎng)物質(zhì)被消耗以及代謝產(chǎn)物的累積，使得部分微生物消亡，此時微生物的增長和消亡趨于穩(wěn)定，3株菌株生物量保持穩(wěn)定；80 h后培養(yǎng)液中可利用營養(yǎng)物質(zhì)完全被利用，微生物逐漸消亡。
2.4.2 3株菌株最適生長溫度、pH及耐乙醇能力試驗
通過紫外分光光度計檢測菌株Y1～Y3經(jīng)不同溫度、不同pH值及不同體積分數(shù)乙醇培養(yǎng)后的OD660nm值，結(jié)果見圖6。
圖6溫度（a）及pH值（b）對3株菌株生長的影響及其耐乙醇能力（c）
由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度、pH值的升高，3株菌株的生物量均呈先增加后降低的趨勢，且3株菌株均在溫度為30～41℃、pH值為5～10、乙醇體積分數(shù)為2%～8%的范圍內(nèi)生長良好。其中，菌株Y1的最佳生長溫度為30℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數(shù)為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分數(shù)為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數(shù)為20%。
3株菌株均能在窖池環(huán)境中良好生長，這與篩選環(huán)境有關(guān)。菌株Y1～Y3來自濃香型窖池底部的優(yōu)級窖泥，長期處于釀酒環(huán)境使得3株菌不斷被馴化，具有較高的耐乙醇能力。此外，這3株菌的最佳生長溫度在30～37℃，這可能表明它們主要生長在濃香型白酒的發(fā)酵的高溫期，窖池內(nèi)糟醅發(fā)酵溫度分為“前緩、中挺、后緩落”三個階段，其中中挺階段發(fā)酵溫度一般在30℃以上。
3結(jié)論
本試驗對窖泥酯化菌的富集方法進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)富集液培養(yǎng)20 d、連續(xù)富集2次，富集液中酯化菌的富集效果最好。采用傳統(tǒng)分離方法從優(yōu)化富集液中分離、篩選得到3株產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯較強的酯化菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株Y1為Clostridium beijerinckii、Y2為Clostridium guangxiense、Y3為Clostridium sartagoforme。通過對3株菌株的生長特性研究發(fā)現(xiàn)，菌株Y1的最佳生長溫度為30℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數(shù)為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分數(shù)為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數(shù)為20%。3株菌株均能在濃香型白酒窖內(nèi)進行很好的生長繁殖，加強這3株菌株的研究對提升濃香型白酒糟醅質(zhì)量具有重要作用。
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