摘要：貓杯狀病毒(FCV)作為導(dǎo)致貓上呼吸道感染的重要病原，具有高度傳染性，嚴(yán)重危害貓科動(dòng)物健康。為了解山西省FCV分離株變異水平及遺傳發(fā)育特征，使用貓腎細(xì)胞(CRFK)分離、純化山西省FCV分離株，用透射電鏡觀察病毒形態(tài)，測(cè)定病毒半數(shù)感染量(TCID50)和生長(zhǎng)曲線，基于結(jié)構(gòu)蛋白VP1分析貓杯狀病毒基因、氨基酸變異水平與遺傳發(fā)育特征。
貓杯狀病毒病是由貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）引起的一種多發(fā)性傳染病，主要引起貓的呼吸道疾病、口炎、關(guān)節(jié)炎和出血性發(fā)熱等。FCV屬于杯狀病毒科、皰疹病毒屬，是一種正二十面體對(duì)稱的球形無(wú)囊膜病毒。近年來(lái)，多個(gè)國(guó)家報(bào)道貓杯狀病毒為高致病性毒株（FCV virulent systemic disease，F(xiàn)CVVSD），引起貓的惡性全身性系統(tǒng)疾病且致死率高達(dá)50%，對(duì)貓及貓科動(dòng)物造成了嚴(yán)重威脅。
FCV為RNA病毒，大小約7.7 kb，全基因組共有3個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），其中ORF1編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1，ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2。衣殼蛋白VP1分為6個(gè)區(qū)域，分別為A、B、C、D、E和F區(qū)，A區(qū)位于1~124aa，是VP1前體被切割掉的VP1前導(dǎo)區(qū)；B區(qū)位于125~397 aa；C區(qū)、E區(qū)變異較大，分別位于398~401 aa和427~524 aa，可變區(qū)E含有主要的B細(xì)胞表位；F區(qū)位于525~668 aa，含有非中和抗原表位。
結(jié)構(gòu)蛋白VP1的變異能夠幫助FCV逃逸宿主的免疫應(yīng)答，其中E區(qū)的5′高變區(qū)426~460 aa處存在4個(gè)線性表位，3′高變區(qū)490~520 aa處存在2個(gè)構(gòu)象表位，是FCV的抗原變異決定簇。通過(guò)分析單克隆抗體逃逸突變體的序列，確定441、448、449和455處存在4個(gè)氨基酸突變。459和462位的兩個(gè)氨基酸參與FCV與細(xì)胞受體fJAM-A結(jié)合，431和433位氨基酸的突變會(huì)導(dǎo)致FCV無(wú)法在體內(nèi)復(fù)制。VP1為高變異度基因，是FCV系統(tǒng)發(fā)育分析的主要基因，也是FCV病原研究、疫苗研發(fā)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。FCV疫苗已在全球范圍內(nèi)廣泛使用，并在FCV感染防控中發(fā)揮巨大作用。但目前FCV感染率仍然很高，由于FCV基因組突變頻繁發(fā)生，現(xiàn)有疫苗無(wú)法保護(hù)貓免受所有FCV毒株的感染。
近年來(lái)，F(xiàn)CV變異株不斷出現(xiàn)，引起病貓嚴(yán)重的全身性疾病，因此明確FCV氨基酸變異與遺傳發(fā)育特征對(duì)防治貓杯狀病毒病至關(guān)重要，但目前缺乏山西省FCV特征及其遺傳變異分析的研究。鑒于此，本試驗(yàn)分離、純化FCV山西株，測(cè)定其病毒滴度和生長(zhǎng)曲線，基于VP1基因闡明FCV山西株同源性及遺傳進(jìn)化水平，旨在為FCV病原及疫苗研究提供理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
細(xì)胞和病料貓腎細(xì)胞（crandell-rees felinekidney cell，CRFK）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院病原與宿主互作實(shí)驗(yàn)室保存，病料收集自山西省FCV感染貓的鼻咽拭子。
1.2主要試劑
病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（DP315），北京天根生化科技有限公司；胰蛋白酶、50×TAE、瓊脂糖和中性紅指示劑、RNase-Free ddH2O，北京索萊寶生物科技有限公司；DNA marker，大連寶生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM），美國(guó)Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1病毒的分離培養(yǎng)
采集FCV感染貓的鼻咽拭子，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋后以0.22μm濾器過(guò)濾，取1/10體積的上清液接種于單層的CRFK細(xì)胞培養(yǎng)2~3 d，盲傳4代，出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，取上清液收獲病毒。
1.3.2噬斑純化試驗(yàn)
取10倍稀釋后的病毒液接種于單層CRFK細(xì)胞，感作2 h后加入2%低熔點(diǎn)瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基預(yù)混液，凝固后將培養(yǎng)板倒置放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)滴加500μL中性紅溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用槍頭挑取噬斑，進(jìn)行下一輪純化。
1.3.3病毒濃縮與純化FCV感染CRFK細(xì)胞，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，6 000 r·min-1離心30 min收集病毒液，使用0.22μm濾器過(guò)濾病毒液后加入攪拌器中，向攪拌器中分別加入PEG 8000和NaCl，使其終濃度分別為7%和3%。4℃、120 r·min-1過(guò)夜攪拌，4℃、8 000 r·min-1環(huán)境下離心60 min，棄上清，用適量PBS溶液（pH值為7.4）重懸沉淀。用PBS溶液（pH值為7.4）配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%、45%、35%和25%的蔗糖溶液，分別取2 mL依次加入超速離心管中，4℃環(huán)境下靜置過(guò)夜。將重懸的病毒液加入蔗糖密度梯度離心管中，4℃環(huán)境以38 000 r·min-1離心4 h，收集離心管中各層液體，進(jìn)行透析與濃縮。
1.3.4透射電鏡觀察
取1滴濃縮后病毒液置于含0.5%Formvar載膜銅網(wǎng)上，常溫干燥后滴加等體積的1%磷鎢酸溶液（pH值7.2）于銅網(wǎng)上負(fù)染1 min。用濾紙吸去多于染液，自然干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察。
2、結(jié)果
病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定
FCV感染CRFK細(xì)胞，分別在第6、第12、第24、第36、第48、第60和第72小時(shí)收集細(xì)胞，凍融3次后離心取上清液，以10-1-10-10的稀釋倍數(shù)接種于96孔板，每個(gè)稀釋倍數(shù)做8個(gè)重復(fù)。
2 h后從培養(yǎng)箱中取出96孔板棄掉病毒液。PBS清洗細(xì)胞，每孔加入100μL 2%DMEM細(xì)胞維持液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞病變，計(jì)算不同感染時(shí)間下的TCID50，繪制生長(zhǎng)曲線。
FCV生長(zhǎng)曲線
根據(jù)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的病變情況，按照Reed-Muench兩氏法計(jì)算出FCV山西株（SX-2021-3）TCID50為10-8.43/mL。比較FCV感染CRFK細(xì)胞不同時(shí)間段（6~72 h），發(fā)現(xiàn)SX-2021-3株在感染CRFK細(xì)胞24 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最大。
結(jié)果顯示，試驗(yàn)純化得3株山西省FCV分離株(SX-2021-1、SX-2021-2和SX-2021-3)，病毒大小約為40 nm，TCID50為10-8.43/mL，F(xiàn)CV感染CRFK細(xì)胞的6~72 h中，在24 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最高(SX-2021-3)。SX-2021-1與SX-2021-2株的VP1基因同源性為99.8%，SX-2021-3株VP1基因呈現(xiàn)較高的變異性，與其他兩株的同源性約為77%。FCV山西分離株與已公布FCV毒株同源性為70.7%~83.9%，其中SX-2021-1、SX-2021-2與我國(guó)黑龍江分離株(HRB-SS)同源性最高(83.9%)，SX-2021-3與我國(guó)上海分離株(SH1)同源性最高(80.5%)。FCV山西分離株VP1蛋白在E區(qū)5′高變區(qū)和3′高變區(qū)均存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，其中SX-2021-3株與其他兩株的VP1蛋白氨基酸差異性明顯。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，F(xiàn)CV山西分離株與疫苗株和VSD毒株親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，SX-2021-1、SX-2021-2與我國(guó)黑龍江地區(qū)分離株(HRB-SS、WZ-1和XH)親緣關(guān)系較近;SX-2021-3與上海毒株(SH1)處于同一分支。綜上，本研究闡明了山西省FCV分離株變異水平及遺傳發(fā)育特征，為FCV病原及疫苗研究提供了重要依據(jù)。
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