Act0988菌株產(chǎn)對(duì)柑橘青霉等多種霉菌具抗菌活性的代謝產(chǎn)物，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定、研究培養(yǎng)條件與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系，以為后續(xù)開發(fā)菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵工藝技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)。以菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定，三角瓶液體振蕩培養(yǎng)研究碳氮源、溫度、pH及氧與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系。結(jié)果表明，Act0988菌株為多產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces polychromogenes），菌株生長(zhǎng)最佳碳源為可溶性淀粉，發(fā)酵液生物量5.8 mg/mL；酵母膏與蛋白胨為最佳氮源，生物量5.7 mg/mL左右。菌株最適溫度28℃，生物量6.0 mg/mL。最適初始pH7.0，生物量6.2 mg/mL；最適裝液量60 mL/500 mL，生物量6.3 mg/mL。Act0988菌株易培養(yǎng)，發(fā)酵液抗菌活性強(qiáng)，菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)具有突出的開發(fā)利用潛力。
在我國(guó)，每年果蔬采后腐爛約8 000萬(wàn)t，經(jīng)濟(jì)損失約750億元，占果蔬產(chǎn)業(yè)總值的30%以上［1］。采收貯運(yùn)中的機(jī)械損傷是病原菌侵入的主要途徑，也是采后果實(shí)腐爛的重要因素。目前控制果蔬采后腐爛的有效方法仍是化學(xué)殺菌劑與冷藏結(jié)合的處理，化學(xué)殺菌劑長(zhǎng)期大量使用既使病菌產(chǎn)生抗藥性，還因殘留影響食用安全以及廢棄藥液造成環(huán)境污染。尋求安全有效、生態(tài)友好的果蔬采后防腐劑替代化學(xué)殺菌劑早已受世人的高度關(guān)注。生物防腐具有無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是果蔬采后無(wú)公害防腐的有效途徑［2］。許多學(xué)者就活體拮抗微生物用于水果采后防腐進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究，分離篩選了多種對(duì)采后蘋果、柑桔、梨等具防腐效果的拮抗菌株［3］。也有以微生物代謝產(chǎn)物用于采后果蔬防腐保鮮的報(bào)道，如李振華等［4］從土壤篩選的6株鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)香蕉炭疽病菌有良好的抑菌作用，申光輝等［5］以黃暗色鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行草莓的防腐保鮮等。
Act0988是從自然界采樣分離、篩選獲得的放線菌拮抗菌株，菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)對(duì)采后柑桔、荔枝、龍眼等果實(shí)上分離的青霉、曲霉、交鏈孢菌等多種引起水果腐爛的霉菌具很強(qiáng)的抗菌活性，抗菌物質(zhì)有350 nm、332 nm及317 nm三個(gè)紫外吸收峰，光譜特征與多烯大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗真菌抗生素光譜特征基本吻合［6，7］，推斷為一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是世界公認(rèn)安全、廣譜、高效的抗真菌抗生素，國(guó)內(nèi)外近年已用于加工食品的防腐，亦有用于防治農(nóng)作物病害的報(bào)道［6，8-10］，而且多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床使用半個(gè)多世紀(jì)幾乎未出現(xiàn)抗藥性［11］。開發(fā)Act0988菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)用于水果采后防腐將具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)與生態(tài)效益。本研究擬針對(duì)Act0988菌株的鑒定、培養(yǎng)條件與菌株生長(zhǎng)關(guān)系進(jìn)行研究，旨為后續(xù)開發(fā)菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵工藝技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種來(lái)源以粵東北地區(qū)采土樣，經(jīng)分離、篩選獲得。
1.1.2指示菌拮抗菌株的篩選及Act0988拮抗菌株發(fā)酵液抗菌活性測(cè)定以青霉菌（Penicillium italicum）為指示菌，菌種由嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2方法
1.2.1 Act0988拮抗菌株的分離、篩選無(wú)菌水浸泡、攪拌，靜置稀釋，稀釋液涂布高氏一號(hào)平板，28℃培養(yǎng)7 d。挑外圍有霉菌透明抑菌圈的單菌落純化，28℃培養(yǎng)3 d，挑單菌落于高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)。純培養(yǎng)物與青霉菌在PDA平板上對(duì)峙接種，28℃培養(yǎng)4 d觀察抑菌效果。經(jīng)多次采樣、分離篩選獲得抑菌效果最佳的純培養(yǎng)為供試菌株，編號(hào)：Act0988。
1.2.2菌株發(fā)酵液的抗菌活性發(fā)酵培養(yǎng)基含玉米淀粉40 g/L、豆餅粉30 g/L、酵母膏1 g/L。玉米淀粉與0.5%α-淀粉酶混合，加適量蒸餾水調(diào)為糊狀，80℃處理30 min，蒸餾水補(bǔ)足1 000 mL，調(diào)pH＝8.0，取100 mL裝入500 mL三角瓶，8層紗布封口，121℃蒸汽滅菌20 min，備用。斜面菌種接于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、200 r/min發(fā)酵6 d，發(fā)酵液6000 r/min離心30 min，收集上清液備用。取1 mL青霉菌孢子懸浮液（108個(gè)孢子/mL）加入90 mm培養(yǎng)皿，倒入PDA培養(yǎng)基20 mL混勻，冷凝后在平板疊放6 mm無(wú)菌濾紙片2張，取發(fā)酵液的離心上清液20μL滴加于濾紙片上，28℃培養(yǎng)72 h，測(cè)量抑菌圈直徑。
1.2.3菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的吸收光譜菌株發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心20 min，沉淀加2倍體積無(wú)水甲醇充分混勻、浸泡，離心，上清液冷凍干燥得粉末粗提物。粗提物再以無(wú)水甲醇溶解、離心，上清液冷凍干燥，樣品再以沃特世1525半制備/分析HPLC純化，收集350 nm主峰洗脫液，凍干后以無(wú)水甲醇溶解，無(wú)水甲醇做基線，在190-1 100 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描得菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的吸收光譜。
1.2.4菌株的菌落與形態(tài)特征菌種接于相應(yīng)培養(yǎng)基的新鮮平板，28℃培養(yǎng)7-14 d，觀察菌落特征。菌種接種于新鮮的高氏一號(hào)平板，將蓋玻片斜插入平板，28℃培養(yǎng)5 d［12］，觀察菌絲和孢子形態(tài)特征。
1.2.5菌株生理生化明膠液化、甲基紅實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原等生理生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基參照《植物研究方法》［12］制備。菌種接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)培養(yǎng)7 d觀察菌株的生理生化特性。
1.2.6菌株的鑒定菌株于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基28℃、150 r/min培養(yǎng)5 d、提取細(xì)胞DNA。以引物A：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，引物B：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'［13］，進(jìn)行菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行堿基測(cè)序，16S rDNA堿基序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比。根據(jù)16S rDNA同源性對(duì)比結(jié)果及菌株的形態(tài)、生理生化特性，參考《放線菌的分類與鑒定》［14］中方法鑒定菌株的屬、種名。
1.2.7碳源、氮源與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系以可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L及酵母膏1 g/L（pH=8）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100 mL培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶，8層紗布封口、滅菌備用。斜面菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)48 h為種子液。以供試碳源20 g/L替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，以供試含氮生化試劑、氮鹽10 g/L替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的蛋白胨，制備不同碳、氮源培養(yǎng)基，100 mL培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶，滅菌備用。每瓶培養(yǎng)基內(nèi)接種子液5 mL，28℃、200 r/min培養(yǎng)96 h，3次重復(fù)。取30 mL發(fā)酵液6 000 r/min離心30 min，沉淀加蒸餾水20 mL混勻、離心，沉淀100℃烘箱過(guò)液，稱菌絲體干重，按如下公式計(jì)算發(fā)酵液的生物量：
生物量=菌絲體干重/發(fā)酵液體積
1.2.8溫度、pH及裝液量與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系種子液5 mL接于裝100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基三角瓶?jī)?nèi)，分別于設(shè)定溫度下200 r/min培養(yǎng)96 h，同上測(cè)定生物量，研究溫度與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系。種子液5 mL接于裝不同pH值基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 mL的三角瓶?jī)?nèi)，28℃、200 r/min培養(yǎng)96 h，同上測(cè)定生物量，研究培養(yǎng)基初始pH與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系。5 mL種子液接于裝有不同體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，28℃、200 r/min培養(yǎng)96 h，取10 mL發(fā)酵液測(cè)定發(fā)酵液生物量，研究裝液量與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系。
2結(jié)果
2.1菌株發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉菌的抗菌活性
Act0988菌株發(fā)酵液離心上清液20μL滴于混有青霉孢子的PDA平板的濾紙片上，28℃培養(yǎng)72 h透明抑菌圈直徑（18.4±0.8）mm，抑菌圈清晰、透明（圖1）。發(fā)酵液平板抑菌實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵液對(duì)青霉菌抗菌活性強(qiáng)、持效期長(zhǎng)，Act0988野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌物質(zhì)的生產(chǎn)能力較大。
圖1菌株發(fā)酵液對(duì)指示菌的PDA平板抗菌活性
2.2菌株抗菌物質(zhì)的吸收光譜
Act0988菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)樣品甲醇溶液經(jīng)紫外—可見光譜掃描的紫外吸收光譜（圖2）顯示，菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)分別在351、333及318 nm有3個(gè)吸收峰，光譜特征與多烯大環(huán)內(nèi)酯類的納他霉素及金褐霉素的光譜特征基本吻合，結(jié)果初步表明菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)屬?gòu)V譜抗真菌的多烯大環(huán)內(nèi)酯類的1種抗生素。
圖2菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的吸收光譜
2.3菌株的形態(tài)、菌落特征
2.3.1菌株的形態(tài)菌株在高氏一號(hào)平板插片培養(yǎng)5 d，顯微鏡觀察，菌株孢子絲單生、直形或松散螺旋，孢子橢圓形、柱形，表面光滑（圖3，圖4）。
2.3.2菌株的菌落特征菌株在麥芽精酵母精瓊脂（ISP2）、燕麥粉瓊脂（ISP3）、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂（ISP4）、甘油天冬素瓊脂（ISP5）等培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d的菌落特征，見表1。
圖3菌株螺旋孢子絲
圖4菌株柱狀孢子
表1菌株在7種培養(yǎng)基上的菌落特征
2.4 Act0988菌株的生理生化
Act0988菌株的生理生化特性及碳源利用測(cè)定結(jié)果，見表2。
表2 Act0988菌株的生理生化特性
2.5 Act0988菌株的鑒定結(jié)果
Act0988菌株16S rDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為1 391 bp，堿基序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源檢索比對(duì)，結(jié)果表明，Act0988菌株堿基序列與多產(chǎn)色鏈霉菌［Streptomyces polychromogenes（NR 0411-09.1）］同源性為100%。Act0988菌株的生物學(xué)特性與《放線菌的分類與鑒定》描述的多產(chǎn)色鏈霉菌基本一致，故將Act0988菌株鑒定為多產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces polychromogenes），系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。
2.6碳、氮源與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系
2.6.1碳源Act0988菌株供試的9種碳源都能生長(zhǎng)，但生物量差異較大。其中，可溶性淀粉培養(yǎng)基的生物量最大，為5.8 mg/mL，與其它碳源培養(yǎng)基生物量的顯著差異；其次是蔗糖和乳糖，發(fā)酵液生物量分別為5.1 mg/mL和5.0 mg/mL，兩者間差異不顯著；菌株在葡萄糖、麥芽糖、丙三醇碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)均較差（圖6）。
圖5 Act0988菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹
2.6.2氮源供試氮源與Act0988菌株生長(zhǎng)的關(guān)系（圖7）表明，菌株對(duì)所有供試氮源都能利用，在以酵母膏與蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中的生物量最大，為5.7 mg/mL左右，兩者差異不顯著（P＜0.05）；牛肉膏培養(yǎng)基的生物量為4.9 mg/mL，尿素培養(yǎng)基的生物量為4.1 mg/mL。菌株以KNO3、NH4NO3或NaNO3為氮源的生物量顯著低于有機(jī)氮源，（NH4）2SO4氮源培養(yǎng)的生物量最低。結(jié)果表明，供試生化試劑類有機(jī)氮源最利于菌株生長(zhǎng)。
圖6碳源與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系
圖7氮源與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系
Act0988放線菌拮抗菌株的鑒定、培養(yǎng)條件與菌株生長(zhǎng)關(guān)系、發(fā)酵工藝（一）
Act0988放線菌拮抗菌株的鑒定、培養(yǎng)條件與菌株生長(zhǎng)關(guān)系、發(fā)酵工藝（二）
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