油橄欖(Olea europaea L.)屬木犀科木犀欖屬，其具有較強的抵抗微生物侵襲能力[1]，可生長幾百年。油橄欖葉提取物早已被地中海地區(qū)的人們當作民間醫(yī)藥來治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等[2]。油橄欖葉提取物具有強的抑菌活性并可分離出橄欖苦苷且含量很高[3]。橄欖苦苷是一種無毒、易被人體吸收[4]的苯酚類裂環(huán)環(huán)烯醚帖苷化合物，有清除超氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、NO和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)的能力[5]，還有抗癌[6-7]、抗血栓[8]、預防動脈硬化和神經(jīng)保護[9-10]等作用。
本實驗通過評價橄欖苦苷的體外抗氧化活性和抑菌活性，為油橄欖葉和橄欖苦苷的藥理活性研究、拓寬應用途徑提供實驗依據(jù)和理論基礎。
1、橄欖苦苷體外抗氧化活性分析
（1）總抗氧化能力
在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被還原性物質還原為Fe2+-TPTZ形式，呈現(xiàn)出明顯的藍色，于593 nm波長處具有最大吸收峰。在Fe3+-TPTZ過量的情況下，檢測藍色物質的生成量可以反映待測物質的總抗氧化能力。如圖2所示，橄欖苦苷總抗氧化能力明顯強于BHT(butylatedhydroxytoluene簡稱，中文名抗氧劑264)，在0.02～0.08 mg/mL質量濃度范圍內橄欖苦苷和BHT總抗氧化能力與其質量濃度成正相關。當質量濃度為0.08 mg/mL時橄欖苦苷抗氧化能力為(52.90±1.58)%，BHT為(48.46±0.03)%。橄欖苦苷總抗氧化能力的IC50為(0.075±0.002)mg/mL，在研究質量濃度范圍內BHT總抗氧化能力低于50%。
（2）總還原能力
由K3Fe(CN)6反應成K4Fe(CN)6，并進一步生成Fe 4[Fe(CN)6]3，這是一有色反應的過程，在700 nm波長處有最大吸收峰，吸光度越大則樣品的還原力越強。如圖3所示，當質量濃度為0.08 mg/mL時，橄欖苦苷總還原能力為(87.59±0.12)%，BHT為(74.66±3.61)%。橄欖苦苷IC50為(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50為(0.023±0.003)mg/mL，IC50差值約0.010 mg/mL，表明橄欖苦苷的總還原能力強于BHT。橄欖苦苷比BHT有更強的總抗氧化能力和總還原能力，這可能是因為羥基鄰位二取代的結構使其具有更強的穩(wěn)定和抗氧化活性[11]。
2、橄欖苦苷抑菌活性分析
（1）抑菌活性
橄欖苦苷對3種細菌的抑菌圈大小和細菌的敏感程度如表1所示。3種細菌對甲醇表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯，橄欖苦苷對3種細菌都有抑菌作用。在不同質量濃度下，橄欖苦甙對3種細菌的敏感度也不同。
結果顯示橄欖苦苷對大腸桿菌的抑菌活性最強，其次為金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌對橄欖苦苷表現(xiàn)出敏感度不高。眾所周知，苯酚類或抗氧化物通過與細胞的肽聚糖作用破壞細胞壁結構或損害細胞膜，兩者一起作用抑制細菌的生長。由于橄欖苦苷羥基鄰位二取代結構的穩(wěn)定性強，以及大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)細胞壁肽聚糖含量低和層次少，橄欖苦苷易于進入和產生抑制作用。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，菌體細胞壁結構緊密，以及芽孢強抗逆性使得橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌的作用較弱。
3、橄欖苦苷對細菌生長曲線的影響
(1)橄欖苦苷對大腸桿菌生長曲線的影響
大腸桿菌在添加不同質量濃度橄欖苦苷培養(yǎng)基中培育36 h的生長狀況如圖4所示。
無菌水代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中細菌在培養(yǎng)6 h后細菌數(shù)增長明顯加快，6～12 h為大腸桿菌的快速生長期。在以甲醇(0.00 mg/mL)代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中大腸桿菌在培養(yǎng)6 h后細菌數(shù)開始增長，1 2 h后適應環(huán)境并快速繁殖，在12～18 h處于快速生長期并達到最大菌液濃度，與無菌水組比較，此時細菌的快速生長期相對延緩，說明甲醇對大腸桿菌的生長有一定的影響。當添加質量濃度為0.01 mg/mL橄欖苦苷溶液時，培養(yǎng)到18 h后大腸桿菌開始增長，在培養(yǎng)24～30 h時處于對數(shù)生長時期。橄欖苦苷質量濃度為0.05、0.10 mg/mL時，在培養(yǎng)24 h后細菌生長并快速進入對數(shù)期，培養(yǎng)30 h后細菌數(shù)還在增加。在質量濃度為0.50、1.00 mg/mL時，36 h內大腸桿菌的生長完全被抑制，說明橄欖苦苷對大腸桿菌的最低抑菌濃度<0.50 mg/mL。表明大腸桿菌隨著橄欖苦苷質量濃度的增加，快速生長期被相應延緩或推遲，細菌的生長周期被相應延長，但是對數(shù)期生長速率沒有受到多大影響。
(2)橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響
如圖5所示，在添加無菌水培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)6 h后數(shù)目增加，在培養(yǎng)12 h左右進入對數(shù)生長時期，培養(yǎng)18 h附近達最大吸光度，此后細菌數(shù)開始緩慢降低。甲醇組(0.00 mg/mL)中的細菌在培養(yǎng)12 h后細菌數(shù)增加較快，18 h左右進入對數(shù)期，培養(yǎng)24 h后達最大菌液濃度，此時對數(shù)期相對無菌水組被延緩，說明甲醇對金黃色葡萄球菌有一定抑菌作用。在加有質量濃度為0.01、0.05 mg/mL橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后繁殖較快，數(shù)目增加明顯，24 h左右進入對數(shù)生長狀態(tài)，培養(yǎng)30 h后金黃色葡萄球菌數(shù)趨于穩(wěn)定。當質量濃度為0.10 mg/mL時，培養(yǎng)18 h細菌開始適應環(huán)境，24 h后進行快速生長，對數(shù)期出現(xiàn)在培養(yǎng)至24～30 h之間。質量濃度為0.50、1.00 mg/mL時36 h內橄欖苦苷完全抑制金黃色葡萄球菌的生長，此時生長曲線為水平狀態(tài)，表明橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度<0.50 mg/mL。橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響同樣表現(xiàn)在對細菌對數(shù)生長期的延緩。
(3)橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響
由圖6可知，無菌水組和甲醇組的枯草芽孢桿菌生長曲線趨于一致，在培養(yǎng)6 h后細菌數(shù)開始增長，6～12 h處于快速生長期，此后細菌數(shù)保持相對穩(wěn)定并開始降低，說明甲醇對枯草芽孢桿菌影響不大或沒有抑制作用。當橄欖苦苷質量濃度為0.01、0.05、0.10 mg/mL時，枯草芽孢桿菌的快速生長被延緩到12～24 h，此時對數(shù)生長期被延緩，細菌生長速率減慢且所需時間范圍變大。當質量濃度為0.50 mg/mL時，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后細菌數(shù)迅速增加，于18～24 h達對數(shù)生長狀態(tài)。橄欖苦苷質量濃度為1.00 mg/mL時，36 h內枯草芽孢桿菌的生長被完全抑制，表明橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度<1.00 mg/mL。橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響表現(xiàn)在細菌數(shù)開始增加到進入對數(shù)生長期和菌液濃度達最大所需的時間范圍被延長，主要還是表現(xiàn)為對快速生長時期的抑制作用。
分別以無菌水和甲醇作為對照，比較不同質量濃度橄欖苦苷對3種細菌生長曲線的影響，結果如表2所示，甲醇對枯草芽孢桿菌的影響很小或沒有抑制作用，甲醇對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但是在抑菌圈測試中，這種作用不明顯，可能是甲醇量少、易揮發(fā)以及橄欖苦苷在瓊脂培養(yǎng)基中擴散效果不好，且微溶于水所致。無論以無菌水還是甲醇作為對照，橄欖苦苷對大腸桿菌的生長抑制效果最佳，對數(shù)期被延緩18、12 h。橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌的抑制效果其次，在0.01、0.05 mg/mL質量濃度時，金黃色葡萄球菌生長的對數(shù)期被延緩12 h，質量濃度達0.10 mg/mL時被延緩18 h，以甲醇為對照被延緩12 h。橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌的生長抑制效果相對較弱，在0.01～0.10 mg/mL質量濃度內，橄欖苦苷對其對數(shù)生長期都延緩6 h，在質量濃度0.50 mg/mL時被延緩12 h。橄欖苦苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度范圍分別為<0.50 mg/mL、<0.50 mg/mL、<1.00 mg/mL。
采用稀釋法分析橄欖苦苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度(圖7)，在質量濃度<0.2 mg/mL時，橄欖苦苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用較強，對枯草芽孢桿菌抑制作用較弱。當橄欖苦苷質量濃度≥0.025 mg/mL時，大腸桿菌吸光度趨為零，因此橄欖苦苷對大腸桿菌的最低抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)為0.025 mg/mL;當橄欖苦苷質量濃度≥0.05 mg/mL時，金黃色葡萄球菌沒有生長，MIC為0.05 mg/mL。有研究報道[21]橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.0312～0.125 mg/mL，與本實驗結果相符合;枯草芽孢桿菌隨橄欖苦苷質量濃度的增加細菌數(shù)減少、生長減慢，在質量濃度>0.1 mg/mL時，培養(yǎng)液的吸光度迅速降低，此時橄欖苦苷濃度細菌生長抑制作用較強，當質量濃度為0.4 mg/mL時，枯草芽孢桿菌生長被完全抑制，此為其最低抑菌濃度。
4、結論
橄欖苦苷體外抗氧化和抑菌活性實驗結果表明：橄欖苦苷具有強的體外抗氧化活性和抑菌作用。在0.02～0.08 mg/mL質量濃度范圍內，與BHT相比較，橄欖苦苷表現(xiàn)出強的總抗氧化能力和總還原能力，總抗氧化能力測定結果表明，橄欖苦苷的IC50為(0.075±0.002)mg/mL，而此時BHT的抗氧化率低于50%;總還原能力測定結果表明，橄欖苦苷的IC50為(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50為(0.023±0.003)mg/mL，差值為0.010 mg/mL。在所研究質量濃度范圍內，橄欖苦苷對大腸桿菌抑制作用最強，抑菌圈直徑可達(20.77±0.47)mm，MIC為0.025 mg/mL;金黃色葡萄球菌對橄欖苦苷表現(xiàn)出高度敏感(d=(19.23±0.44)mm)，MIC為0.05 mg/mL;而橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌抑制作用相對較弱，處于中度敏感狀態(tài)，MIC為0.4 mg/mL。橄欖苦苷對3種細菌生長曲線的影響表現(xiàn)在對其對數(shù)生長期的延緩。對大腸桿菌的抑制作用極顯著強于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌(P<0.01)，金黃色葡萄球菌對橄欖苦苷的敏感度高于枯草芽孢桿菌(P<0.05)。這為橄欖苦苷在食品、化妝品和醫(yī)藥等領域的應用和研究提供了參考。
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