1.材料與方法
1.1材料與儀器
人參市售6年新鮮人參，產(chǎn)地吉林；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（CL-0190）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549（CL-0016）、Ham，s F-12K（WHB823P231）、RAW264.7專用培養(yǎng)基（WHAA23G033）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；LPS（S11060）購自上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（P0012）、細(xì)胞周期試劑盒（C1052）、細(xì)胞凋亡試劑盒（C1062M）購自上海碧云天公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AU341）、基因擴(kuò)增試劑盒（AQ601）購自全式金生物科技有限公司；β-Actin Rabbit mAb（AP0060）、TLR4 polyclonal antibody（BS91353）、MyD88 Rabbit monoclonal antibody（BS40219）、iNOS Rabbit monoclonal antibody（BS40374）、COX-2 polyclonal antibody（BS90326）購自Bioworld；NF-κB P65 Rabbit mAb（8242T）購自美國CST；FITC anti-mouse CD80 antibody（104705）購自Biolegend。
Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司；111型二氧化碳培養(yǎng)箱美國Thermo公司；IX73熒光顯微鏡日本Lympus公司；1645050型蛋白凝膠電泳儀美國BIO-RAD公司；FL1000 iBright智能成像系統(tǒng)美國賽默飛世爾科技有限公司；CFX96熒光定量PCR儀美國BIO-RAD公司
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1人參外泌體的提取純化
1.2.1.1人參外泌體的提取
對(duì)鮮參中的人參外泌體進(jìn)行提取，具體提取純化方法如下：將人參清洗干凈，在勻漿器中加入PBS勻漿，過濾，加入蛋白酶抑制劑，使用1 mol·L?1 Tris-HCl調(diào)人參液的pH至7，在轉(zhuǎn)速為400×g、800×g和10000×g條件下離心20 min取上清液，再用超速離心機(jī)在100000×g下離心1 h，用20 mmol·L?1 Tris-HCl重懸并充分渦旋沉淀。
1.2.1.2人參外泌體的純化
二濃度蔗糖墊純化：配制1 mol·L?1、2 mol·L?1蔗糖溶液，在離心管內(nèi)依次加入樣品溶液、1 mol·L?1和2 mol·L?1蔗糖溶液，100000×g離心1 h，輕輕吸取樣品層，然后加入20 mmol·L?1的Tris-HCl至全管，100000×g離心1 h，洗去多余的蔗糖，再用20 mmol·L?1的Tris-HCl重懸并充分渦旋沉淀，獲得純化的人參外泌體。本課題組通過透射電子顯微鏡觀察人參外泌體，結(jié)果顯示，純化后的外泌體形態(tài)均一，粒徑集中在317.90±4.43 nm，其外部有明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)，整體呈大小不一的茶托樣或半球樣結(jié)構(gòu)，符合外泌體顯微鑒別特征；通過BCA試劑盒測(cè)定純化后人參外泌體蛋白質(zhì)的濃度，根據(jù)不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在562 nm處的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出純化后人參外泌體的收率為103 mg/kg。
1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備
RAW264.7細(xì)胞使用RAW264.7細(xì)胞專用培養(yǎng)基養(yǎng)，置于37℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h，陽性組給予1μg·mL?1的LPS刺激，給藥組加入濃度5、10、20μg·mL?1的人參外泌體，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以2000 r/min離心10 min，并通過0.22μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，制備成條件培養(yǎng)基（CM）。A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%鏈霉素和青霉素的Ham's F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入條件培養(yǎng)基2 mL后共培養(yǎng)24 h。
1.2.3人參外泌體對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
收集對(duì)數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以密度為2×104個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組；陰性對(duì)照組（20 mmol·mL?1的Tris-HCl）；陽性對(duì)照組（1μg·mL?1的LPS）；人參外泌體給藥組（人參外泌體濃度為5、10、20μg·mL?1），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24 h后，在避光條件下，加入CCK-8，37℃孵育30 min；在波長為450 nm處檢測(cè)各孔OD值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：
式中；A0為空白組的OD值；A樣本為實(shí)驗(yàn)組的OD值；A空白為對(duì)照組OD值。
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