研究背景
該研究旨在克服由于正選擇引起的抗生素結(jié)合位點(diǎn)研究的局限性。
研究人員關(guān)注大腸桿菌RNA聚合酶（RNAP）中的利福平（Rif）結(jié)合位點(diǎn)。
該研究探討了在Rif結(jié)合位點(diǎn)中的單殘基突變的遺傳圖譜，以了解其功能特性。
通過使用多重自動化基因組工程（MAGE），研究人員生成了RNA聚合酶（RNAP）突變體的全面集合。
研究目標(biāo)
評估Rif結(jié)合位點(diǎn)中的突變對Rif結(jié)合親和力和殺菌活性的影響。
研究突變對RNAP速度、核苷酸可用性和細(xì)菌對抗生素的敏感性的影響。
分析利福平結(jié)合位點(diǎn)的天然序列多樣性，以及其與功能性突變和抗生素抗性的關(guān)聯(lián)。
考察轉(zhuǎn)錄速度在細(xì)菌生理、抗生素抗性和在不同溫度下的生長優(yōu)勢中的作用。
研究引起利福平導(dǎo)致的DNA損傷的機(jī)制，以及其對細(xì)胞存活和DNA修復(fù)的影響。
了解轉(zhuǎn)錄速度、藥物敏感性以及特定藥物響應(yīng)基因的表達(dá)之間的關(guān)系。
主要發(fā)現(xiàn)
研究人員進(jìn)行了一項研究，以克服由于正選擇引起的研究抗生素結(jié)合位點(diǎn)的限制。他們在大腸桿菌RNA聚合酶（RNAP）的利福平（Rif）結(jié)合位點(diǎn)中生成并分析了760個單殘基突變體。
在特定的α螺旋區(qū)域中的突變大大影響了利福平的結(jié)合，并通過誘導(dǎo)致命性DNA斷裂將該藥物從細(xì)菌生長抑制型轉(zhuǎn)化為殺菌型。
在其他結(jié)合位點(diǎn)的突變增加了RNAP速度，導(dǎo)致核苷酸耗盡，細(xì)菌更容易受到抗生素的影響，并在較低溫度下提供了生長優(yōu)勢。
rpoB基因中的天然序列多樣性經(jīng)常導(dǎo)致功能性利福平結(jié)合位點(diǎn)突變，改變了RNAP的特性或賦予了抗藥性。
這項研究有助于理解抗生素抗性和必需酶特性。
細(xì)菌RNA聚合酶的Rif結(jié)合位點(diǎn)被明確定義，抗性突變體因突變酶中的變化而表現(xiàn)出不同的表型。
多重自動化基因組工程（MAGE）允許高效而特定地引入和監(jiān)測突變。
生成了RNA聚合酶（RNAP）突變體的全面集合，以探索利福平（Rif）的結(jié)合相互作用以及其殺菌/抑菌效應(yīng)。
在RNA聚合酶的特定α螺旋區(qū)域中的突變改變了利福平的效力，通過誘導(dǎo)DNA斷裂將其從抑菌型轉(zhuǎn)化為殺菌型。
增加RNAP速度的突變導(dǎo)致核苷酸耗盡，使細(xì)菌更容易受到抗生素的影響，并在較低溫度下提供生長優(yōu)勢。
對RNA聚合酶Rif結(jié)合位點(diǎn)的突變進(jìn)行了詳細(xì)分析，揭示了它們對不同藥物的抗性和敏感性的影響。
在特定位置的突變增加了對Rif的抗性，并與特定氨基酸殘基在Rif結(jié)合中的重要性相關(guān)聯(lián)。
某些突變導(dǎo)致對Rif的高水平抗性，而其他突變則導(dǎo)致對5-氟尿嘧啶（5FU）和雙環(huán)霉素（BCM）的增加敏感性。
RNAP的速度影響了對5FU和BCM的敏感性或抗性，伴隨突變率和核苷酸可用性的改變。
該研究考察了Rif結(jié)合位點(diǎn)的天然變異，并確定了具有功能性表型的特定突變。
在特定突變體中觀察到對Rif的高水平抗性和增加的敏感性。
在不同細(xì)菌物種中流行的特定位置的突變與快速RNAP或特定環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)。
需要進(jìn)一步研究以了解這些突變在不同生物體中的影響。
該研究揭示了一種將抑菌型藥物轉(zhuǎn)化為殺菌型藥物的機(jī)制，涉及到增強(qiáng)與其靶標(biāo)的結(jié)合親和力。
利福平（Rifampicin）誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂和SOS反應(yīng)的激活，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)突變體中的細(xì)胞死亡。
利福平的作用機(jī)制與其他抗生素不同，不依賴于產(chǎn)生活性氧自由基。
提高利福平的結(jié)合親和力可以增強(qiáng)其抗微生物活性并縮短治療時間。
該研究還確定了影響RNAP速度和對核苷酸耗盡的脆弱性的其他突變。
該研究突出了轉(zhuǎn)錄速度在決定核苷酸可用性、改變抗生素敏感性以及改變細(xì)菌在不同溫度下的最佳生長溫度方面的作用。
快速RNAP突變體由于核苷酸耗盡和終止效率低下而導(dǎo)致對某些藥物的增加敏感性。
影響RNAP速度的突變體在較低溫度下提供了生長優(yōu)勢，但在較高溫度下不具備競爭優(yōu)勢。
該研究為細(xì)菌生理學(xué)、進(jìn)化和抗生素開發(fā)提供了見解和潛在途徑。
Rif結(jié)合位點(diǎn)顯示高度的進(jìn)化保守性，功能性突變體超越了抗性，為結(jié)合位點(diǎn)的“耐藥基因組”做出了貢獻(xiàn)。
Rif結(jié)合位點(diǎn)的多功能性對于旨在增強(qiáng)抗生素效力的藥物化學(xué)家具有重要意義。
對可變性、抗性和敏感性模式的比較分析可以增進(jìn)對抗生素機(jī)制的理解并指導(dǎo)聯(lián)合治療方案的制定。
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