魚類是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食物來(lái)源，因其多種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被推薦使用。它的飽和脂肪含量低，富含多不飽和脂肪酸(PUFA)和蛋白質(zhì)。然而，鮮魚在被屠宰后質(zhì)量很容易變差。大多數(shù)魚類被消化酶和脂肪酶、微生物腐敗和表面細(xì)菌氧化降解。熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，被認(rèn)為是魚和魚產(chǎn)品冷藏過(guò)程中常見的特定腐敗生物。近年來(lái)，研究人員付出了相當(dāng)大的努力來(lái)尋找天然防腐劑，以減緩或抑制魚類中細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，越來(lái)越多的消費(fèi)者意識(shí)到合成防腐劑對(duì)健康的潛在負(fù)面影響和天然添加劑的好處，這促使食品行業(yè)尋求天然產(chǎn)品作為替代品。許多來(lái)自植物的防腐劑已被證明具有抗氧化或抗菌特性。瑞香素（7,8-二羥基香豆素）是來(lái)源于植物的香豆素的二羥基衍生物。它是從韓國(guó)達(dá)芙妮中提取的植物活性元素，已報(bào)道具有抗微生物，抗氧化，抗瘧藥，抗凝，和免疫調(diào)節(jié)活性。然而，瑞香素對(duì)食源性腐敗菌的潛在影響鮮有報(bào)道。因此，熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，作為魚和魚制品中的特定腐敗菌（SSOs），被選作目標(biāo)的細(xì)菌，以評(píng)估對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞瑞香素的抗菌活性和作用機(jī)制，以提供一個(gè)基礎(chǔ)，瑞香素在食品替代化學(xué)防腐劑行業(yè)。
應(yīng)用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀在30°C培養(yǎng)基中測(cè)試細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD值為0.1，然后將150uL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100孔微量滴定板（Bioscreen，芬蘭）的每個(gè)孔中。細(xì)菌懸液分別與1×、2×和4×MIC瑞香素混合。0×MIC用作對(duì)照。細(xì)菌在30°C下進(jìn)一步培養(yǎng)，并使用自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀在600 nm處監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD 600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本研究報(bào)道了瑞香素對(duì)熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的抗菌活性及其作用機(jī)制。瑞香素對(duì)熒光假單胞菌的MIC為0.16 mg·mL-1，對(duì)腐敗希瓦氏菌的MIC為0.08 mg·mL-1。瑞香素可以破壞熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的細(xì)胞壁和膜完整性，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞內(nèi)的AKP和ATPase活性。SEM和TEM結(jié)果表明，瑞香素誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)改變并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的滲漏。熒光假單胞菌的FTIR光譜和S.putrefaciens起訴瑞香素破壞在膜和導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制的核酸和蛋白質(zhì)泄漏磷脂結(jié)構(gòu)熒光假單胞菌和S.putrefaciens?？傮w而言，研究結(jié)果表明，瑞香素是一種很有前途的天然防腐劑，可用作食品工業(yè)中合成防腐劑的潛在替代品，為增強(qiáng)微生物滅活提供了可行的策略。
圖1、瑞香素對(duì)熒光假單胞菌(a)和腐敗假單胞菌(b)的生長(zhǎng)曲線。繪制了兩種試驗(yàn)細(xì)菌在不同濃度瑞香素存在下的生長(zhǎng)情況，以進(jìn)一步分析瑞香素的抗菌活性。如圖(a)所示，對(duì)照組細(xì)菌的生長(zhǎng)與S形生長(zhǎng)曲線一致。熒光假單胞菌在沒(méi)有瑞香素的情況下快速生長(zhǎng)，6小時(shí)后開始進(jìn)入指數(shù)噬菌體，26小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定期。然而，用1×、2×和4×MIC濃度的瑞香素處理的組完全抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。腐敗假單胞菌（圖(b))不添加瑞香素的情況下，14小時(shí)后開始呈指數(shù)期，28小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定期。加入1×MIC瑞香素后，腐敗假單胞菌的生長(zhǎng)速度比對(duì)照慢。30 h后抑制作用逐漸減弱，細(xì)菌生長(zhǎng)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期。然而，當(dāng)添加2×MIC和4×MIC濃度的瑞香素時(shí)，可以完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
圖2、堿性磷酸酶(AKP)活性(a)、細(xì)胞內(nèi)核酸(b)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的滲漏(c)、蛋白質(zhì)滲漏(d)以及瑞香素對(duì)熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的ATPase活性(e)。
圖3、用瑞香素處理的熒光假單胞菌(a)和腐敗鏈球菌(b)的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜。
圖4、熒光假單胞菌（a）和腐敗希瓦氏菌(b)的掃描電子顯微照片（A1–B1，對(duì)照；A2–B2，添加1×MIC瑞香素；A3–B3，添加2×MIC瑞香素；A4–B4，添加4×MIC瑞香素。
圖5、熒光假單胞菌（a）和腐敗希瓦氏菌(b)（A1-B1，對(duì)照；A2-B2，添加4×MIC瑞香素）的透射電子顯微照片。
總結(jié)：本論文主要研究評(píng)估了瑞香素對(duì)熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的抗菌活性和作用機(jī)制。瑞香素對(duì)熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.16和0.08 mg·mL-1。應(yīng)用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀獲得的生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)也表明瑞香素具有良好的抗菌作用。細(xì)胞內(nèi)成分滲漏和細(xì)胞活力分析結(jié)果表明，瑞香素破壞了細(xì)胞膜的形態(tài)。根據(jù)掃描電鏡和透射電鏡觀察，處理后的兩株菌體細(xì)胞膜形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，證實(shí)了瑞香素對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞。研究結(jié)果表明，瑞香素主要通過(guò)破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用，表明其具有作為天然食品防腐劑的良好潛力。
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