為深入學(xué)習(xí)細(xì)菌生長曲線測定方法，并使其在教學(xué)、科研和生產(chǎn)中得到更好應(yīng)用，以實驗室分離菌株為研究對象，以大腸埃希菌生長曲線的測定為實驗方法，并對該方法的應(yīng)用進(jìn)行了研究并提出改進(jìn)方案。研究結(jié)果表明，采用上述方法僅測出2株葡萄球菌屬菌株的生長曲線，采取增加溶氧量、單瓶培養(yǎng)及取樣后立即測定，得到3株芽胞桿菌屬菌株的生長曲線，而對產(chǎn)色素的考克氏菌屬菌株宜采用平板菌落計數(shù)的方法進(jìn)行生長曲線的繪制。不同菌屬菌株生長曲線的測定要根據(jù)實際情況選擇合適方法，測定過程要防止低溫保存對菌液光密度的影響。
微生物學(xué)實驗技術(shù)和方法是微生物學(xué)建立和發(fā)展的基礎(chǔ)，各學(xué)科的交叉和滲透極大地豐富了微生物學(xué)實驗技術(shù)的內(nèi)容，并將其推向一個新的發(fā)展階段。微生物學(xué)是一門內(nèi)容豐富、與人類關(guān)系密切、極富探索性和實用性的學(xué)科，具有很強(qiáng)的實踐性和應(yīng)用性。近年來微生物學(xué)實驗技術(shù)和方法逐漸滲透到食品工業(yè)[1]、發(fā)酵工業(yè)[2]、生物工程[3]和環(huán)境保護(hù)[4]等領(lǐng)域，以實現(xiàn)利用和保護(hù)有益微生物、控制和消滅有害微生物的目的。微生物的生長繁殖有一定規(guī)律性，可分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段[5]，其中延遲期和穩(wěn)定期具有重要的實際應(yīng)用價值，尤其在食品工業(yè)和發(fā)酵工業(yè)中。延遲期的長短受各種外界因素的影響，包括氧氣、溫度、濕度等。人們可以根據(jù)控制外界環(huán)境條件來延長延遲期的時間，一旦度過延遲期，即標(biāo)志著食品保質(zhì)期的結(jié)束[6]。穩(wěn)定期特點是菌體繁殖速度和生理活性開始下降，但培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物卻在這段時間得到大量積累，生產(chǎn)上常掌握這一特點以得到大量代謝產(chǎn)物。例如，醬油生產(chǎn)中制曲目的是為了得到大量的酶，而米曲霉所分泌的代謝產(chǎn)物中蛋白酶和淀粉酶均在菌體進(jìn)入衰老期前活力最高，根據(jù)這一特點來確定出曲時間[7]。在醫(yī)學(xué)上，根據(jù)微生物生長曲線，選擇恰當(dāng)時間轉(zhuǎn)種培養(yǎng)(對數(shù)期或穩(wěn)定期)以提高陽性菌檢出率[8-9]。另外，微生物生長曲線在廢水治理中也具有重要的實踐指導(dǎo)意義，通過生長曲線的形態(tài)為處理工藝的改進(jìn)提供參考[10]。大腸埃希菌生長曲線的測定在大多數(shù)微生物學(xué)實驗教材中有介紹[11-14]，且采用基本相同的實驗方案。然而在實際應(yīng)用中套用大腸埃希菌生長曲線的測定方法來制作其他微生物的生長曲線，將會出現(xiàn)預(yù)料不到的困難和問題。
為強(qiáng)化該方案的應(yīng)用性，以沈萍主編的《微生物學(xué)實驗》第4版中大腸埃希菌生長曲線的制作為出發(fā)點，以實驗室分離保存的菌株為研究對象，對該測定方法在實際應(yīng)用中所出現(xiàn)的問題進(jìn)行了討論并提出了解決方案，以期為微生物實驗教學(xué)的改進(jìn)提供指導(dǎo)，也為在該專業(yè)和相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種來源實驗室分離保存的6株菌株AY2、AY7、AY9、AG4、AG13和AG18(通過分子鑒定初步判定菌株AG4、AG13和AG18為芽胞桿菌屬，菌株AY2和AY7為葡萄球菌屬，菌株AY9為考克氏菌屬)。
1.1.2培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
1.1.3試劑及儀器牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉均為國產(chǎn)分析純試劑。分光光度計(TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、比色杯(光徑為10 mm)、恒溫?fù)u床、試管、三角瓶等。
1.2方法
1.2.1常規(guī)方法參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。取各菌株種子液(OD600約為1)，按5%接種量轉(zhuǎn)接至盛有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5 mL混合液放入已標(biāo)記好培養(yǎng)時間的20支試管(15 mm×150 mm)中，硅膠塞封口，每時間點設(shè)置3次重復(fù)。將已接種的試管置搖床37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，按標(biāo)記的培養(yǎng)時間取出試管，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其600 nm波長處的光密度值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。
1.2.2改進(jìn)方法①在常規(guī)方法基礎(chǔ)上，采用50 mL離心管(28 mm×105 mm)，封瓶膜(16 cm×16 cm)封口，以此增加培養(yǎng)液中的溶氧量，每時間點設(shè)置3次重復(fù)，其余操作不變。②在常規(guī)方法基礎(chǔ)上，將菌株培養(yǎng)液按不同時間分別培養(yǎng)改為同一培養(yǎng)瓶連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶換為500 mL三角瓶，封瓶膜封口，按不同培養(yǎng)時間取出培養(yǎng)液后立即測定OD值，每時間點設(shè)置3次重復(fù)，其余操作不變。這一做法在于增加溶氧量，單瓶培養(yǎng)以避免不同培養(yǎng)瓶中接種量的差異，取樣后立即測定以避免低溫保存對菌液光密度的影響。
2、結(jié)果與分析
2.1不同因素對菌株生長曲線的影響
2.1.1菌齡和接種量菌種的菌齡和接種量影響適應(yīng)期的長短，以代謝活躍的對數(shù)期的“種子”接種則子代培養(yǎng)的適應(yīng)期就短[15]，而接種量低菌體生長慢適應(yīng)期就長，反之接種量大菌體生長過快適應(yīng)期短以至較早進(jìn)入對數(shù)期[16]。有研究表明，當(dāng)接種量增加至7%～10%時，菌株生長的差異不明顯，接種量低于5%時發(fā)酵延緩或不發(fā)酵[17]。本研究接種量選擇為5%，種子液為培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，6株菌中除了菌株AG4和菌株AY9，其余各菌株適應(yīng)期均較短(圖1、圖2)。
2.1.2培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度影響細(xì)胞內(nèi)酶活力和細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長繁殖。有研究表明，雙歧桿菌屬細(xì)菌的最適生長溫度在37～42℃，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期后OD600最大值為1.96[17-19]。溫度過高或過低均不利于微生物的生長，本研究以37℃作為實驗菌株的培養(yǎng)溫度，除了菌株AY7和AY9之外，其他菌株在穩(wěn)定期時OD600均接近2.0，說明37℃可能較為適合這些菌株的生長。然而不同菌屬細(xì)菌及同屬內(nèi)不同菌株的生長最適溫度可能不同，對此還有待進(jìn)一步研究。
2.1.3需氧量不同菌株對氧氣的需求程度是不同的，如雙歧桿菌要在無氧條件下生長[17]，而某些厭氧菌在微氧條件下比在完全厭氧條件下生長好[20]。本研究改進(jìn)方法①中通過增加培養(yǎng)瓶容積以及培養(yǎng)液接觸空氣的面積以增加培養(yǎng)液的溶氧量，這有利于好氧菌的生長，即有利于菌株AG13和菌株AG18的生長(圖2)，這2株菌歸屬于芽胞桿菌屬。由圖3和圖4可以看出溶氧量對菌株AG4和AY9的生長可能均有影響，而對菌株AY2和AY7的影響較小(圖1)。
圖1菌株AY2和菌株AY7的生長曲線(常規(guī)方法)Fig.1 Growth curve of strain AY2 and AY7(Conventional method)
圖2菌株AG13和菌株AG18的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain AG13 and AG18A：常規(guī)方法；B:改進(jìn)方法①A：Conventional method;B:Improvement method one
2.1.4檢測時間常規(guī)方法測定生長曲線，是將不同培養(yǎng)時間菌株培養(yǎng)液取出放冰箱保存最后統(tǒng)一測定OD值，結(jié)果表明，雖然工作量減少，但冰箱保存菌株會影響菌液吸光度的測定。菌株AG4培養(yǎng)至24 hOD600為1.618，放入4℃冰箱保存24 h后OD600為1.268，而其他菌株OD值幾乎不受影響。因此本研究改進(jìn)方法②中采取取樣后立即測定OD值以避免冰箱保存對細(xì)菌活力的影響。結(jié)果顯示菌株AG4在前兩次測定中OD值均偏低，除了冰箱保存對菌株細(xì)胞數(shù)量的影響外溶氧量也可能起到一定作用(圖3)，相比之下溶氧量對菌株AY9的影響可能較大(圖4)。
2.1.5其他方面通過對常規(guī)方法進(jìn)行改進(jìn)完成了三種不同菌屬菌株生長曲線的測定，從曲線形態(tài)看分兩種類型，一是含有四個時期的全過程動態(tài)，二是沒有衰亡期的曲線形態(tài)。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株AY9的生長曲線不但沒有出現(xiàn)衰亡期，反而出現(xiàn)穩(wěn)定期后又有增長趨勢(圖4)，可能因為菌株AY9產(chǎn)紅色素而影響了吸光度的測定。
圖3菌株AG4的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain AG4A：常規(guī)方法；B:改進(jìn)方法①；C:改進(jìn)方法②，圖4同A：Conventional method;B:Improvement method one;C:Improvement method two
圖4菌株AY9的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain AY9
2.2不同微生物生長曲線測定方法的比較
2.2.1光電比濁法該法簡便、迅速，可以連續(xù)測定，是大多數(shù)微生物學(xué)實驗教材中測定大腸埃希菌生長曲線所采用的方法[11-14]，很多研究工作也采取該方法進(jìn)行微生物生長曲線的測定[21-26]，然而此方法并不適用于所有菌株。本研究所用菌株已通過分子鑒定，初步判定分別屬于芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬和考克氏菌屬，與大腸埃希菌是完全不同的屬，但歸屬于葡萄球菌屬的菌株AY2和菌株AY7(圖1)，可采用該方法進(jìn)行生長曲線的測定，這兩株菌可能與大腸埃希菌具有相同的生長繁殖快、易培養(yǎng)且在生長周期中個體形態(tài)較穩(wěn)定的特點。另外光電比濁法所測光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌和死菌，故衰亡期的測定不明顯或沒有，本研究也出現(xiàn)了這種情況(圖2)。
2.2.2其他方法除了光電比濁法測定生長曲線外，微生物生長曲線的測定還包括平板菌落計數(shù)法和顯微鏡直接計數(shù)法等，均是通過細(xì)菌數(shù)量的測量來繪制生長曲線。平板菌落計數(shù)法能直接反映樣品中活細(xì)胞數(shù)量，被廣泛用于生物制品、食品、飲料、水以及多類產(chǎn)品等質(zhì)量檢測與控制的標(biāo)準(zhǔn)方法。顯微鏡直接計數(shù)法具有直觀、快速、操作簡單的優(yōu)點，但不能區(qū)分死活細(xì)胞。由于AY9為考克氏菌屬中產(chǎn)色素的菌株，其生長曲線在穩(wěn)定期后有上升趨勢(圖4)，故對產(chǎn)色素的菌株可采用平板菌落計數(shù)的方法測定生長曲線。
2.3 OD值與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系
光電比濁法測定微生物生長曲線的關(guān)鍵之處就是要準(zhǔn)確測出菌懸液的OD值，且測量波長通常采用600 nm。若菌懸液濃度太大就會超出儀器的測量范圍，或即使測出OD值也不能反映菌體數(shù)量。對此很多高校使用的微生物學(xué)實驗指導(dǎo)中并未指出明確的解決辦法，或者只是說明對細(xì)胞密度大的菌懸液要適當(dāng)稀釋，使其光密度在0.1～0.65之間即可，對如何繪制光密度-培養(yǎng)時間的生長曲線并未做說明。也有些實驗指導(dǎo)書中采用稀釋后測得的OD值乘以稀釋倍數(shù)作為實際OD值來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，這顯然是不正確的。
有研究表明，對數(shù)期以后OD600值與菌體數(shù)量不呈線性關(guān)系，而在穩(wěn)定期以前兩者線性關(guān)系良好，指出菌懸液稀釋倍數(shù)與實際OD600值間并不是簡單的倍數(shù)關(guān)系而是乘冪關(guān)系[27-29]。馬勇等[30]對高濃度培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋使OD值在0.1～0.8之間，然后建立相關(guān)稀釋倍數(shù)間的OD值回歸方程，利用回歸后的OD值繪制生長曲線。盡管有些菌株在對數(shù)期時所測培養(yǎng)液OD值可能超出0.1～0.8的范圍甚至達(dá)到3.0，但OD值與菌體細(xì)胞數(shù)量之間仍然有較好的線性關(guān)系[29]。對數(shù)期的菌株細(xì)胞生長旺盛，死亡細(xì)胞很少，可直接使用實測OD值反映菌液的細(xì)胞濃度，只要所測OD值不超出儀器測量范圍。本研究對高濃度培養(yǎng)液未做稀釋也未建立相關(guān)稀釋倍數(shù)間的回歸方程，仍然可以得到大部分菌株的生長曲線(圖1、圖2、圖3)，盡管有些菌株生長曲線沒有明顯衰亡期，但這并不影響生長曲線的走向以及對菌株對數(shù)期和穩(wěn)定期的判斷。
3、討論
微生物生長曲線的測定具有很強(qiáng)的實踐性和實際應(yīng)用性，無論采用哪種方法均耗時費力。由本文研究結(jié)果提出幾點建議：①可采用加大接種量以縮短實驗時間，使其在教學(xué)中得到開展；②選擇適宜的生長曲線測定方法，如對產(chǎn)色素或含有其他干擾物質(zhì)的微生物宜采用平板菌落計數(shù)的方法測定生長曲線；③了解菌株的最適生長條件，如溫度、通氣量；④以對數(shù)期的“種子”接種，接種量根據(jù)情況而定；⑤避免冰箱保存菌株培養(yǎng)液，建議取樣后立即測定。總之要根據(jù)實際情況以及菌株各自的特點選擇合適的方法進(jìn)行生長曲線的測定。
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