摘要:自然界中微生物種類繁多、功能多樣、分布廣泛，對人類健康安全、生態(tài)穩(wěn)定和物種進(jìn)化等發(fā)揮不可替代的作用。盡管微生物培養(yǎng)技術(shù)至今已有一百多年，然而由于各種限制因素的制約，目前成功分離培養(yǎng)的微生物僅占0.1%?1.0%，自然界中仍有十分豐富的微生物資源有待挖掘和開發(fā)利用。如何理解難培養(yǎng)微生物的制約因素并探索作用機制，同時借此開發(fā)新型微生物培養(yǎng)方法則尤為必要。本文首先分析了典型環(huán)境微生物生長的限制因素，然后介紹了目前利用傳統(tǒng)培養(yǎng)改進(jìn)措施進(jìn)行分離篩選的研究成果，進(jìn)一步綜述了原位培養(yǎng)、共培養(yǎng)、微流控培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞分選技術(shù)等新型培養(yǎng)技術(shù)在難培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)中的應(yīng)用，最后對目前培養(yǎng)法存在的瓶頸問題進(jìn)行深入分析，提出今后可在多技術(shù)聯(lián)合使用、難培養(yǎng)微生物復(fù)蘇機制、微生物互作機制、代謝途徑與調(diào)控機制等方面進(jìn)行研究，以期為今后微生物資源開發(fā)利用提供借鑒。
地球生物圈中微生物種類繁多、功能多樣，它們扮演著生產(chǎn)者、消費者和分解者的角色，廣泛參與碳、氮、硫等各種生物地化循環(huán)。據(jù)推算，大約有1011-1012種微生物存在于地球的各個生物圈中[1]。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離微生物至今150多年，成千上萬種微生物得以分離，但截至目前可培養(yǎng)微生物僅占總微生物的0.1%-1.0%[2]。絕大部分微生物無法培養(yǎng)，這些微生物常常被稱為“暗物質(zhì)”。盡管隨著基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，如克隆文庫、變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH)、實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR，qPCR)、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)和高通量測序等分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，越來越多的微生物通過免培養(yǎng)技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，功能基因被陸續(xù)挖掘并利用。然而這些分子生物技術(shù)并不能替代培養(yǎng)法。其原因在于，即使通過(宏)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了代謝途徑獨特新穎、功能強大的微生物，如果不能分離篩選這些微生物，其生理特點、代謝機制及生態(tài)功能就無法研究驗證，應(yīng)用也就無從談起[3]。因此，測序法和培養(yǎng)法應(yīng)互為補充，缺一不可。近年來，絕跡稀釋法(Dilution-to-Extinction)、原位培養(yǎng)、共培養(yǎng)(Co-Culture)、流式細(xì)胞分選技術(shù)及微流控培養(yǎng)技術(shù)等新型培養(yǎng)方法陸續(xù)出現(xiàn)，為高效地分離篩選更多微生物帶來了曙光。
本文首先分析了環(huán)境微生物生長的典型限制因素。然后，對傳統(tǒng)培養(yǎng)法的改進(jìn)措施、新型培養(yǎng)手段(原位培養(yǎng)、高通量培養(yǎng)法、微流控培養(yǎng)技術(shù)等)的原理、特點及優(yōu)缺點進(jìn)行介紹，分析并總結(jié)現(xiàn)今培養(yǎng)法的研究成果。最后，對目前培養(yǎng)法的瓶頸問題進(jìn)行分析并提出解決措施，以期為今后利用培養(yǎng)法分離篩選更多微生物，特別是難培養(yǎng)的功能微生物的培養(yǎng)提供參考。
1未培養(yǎng)環(huán)境微生物生長的限制因素
自然界中生長的微生物在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下不能生長，原因可能有7種。
1.1大多數(shù)未培養(yǎng)微生物處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)
自然環(huán)境中有99%以上的微生物處于活的非可培養(yǎng)(Viable but Non-Culturable，VBNC)狀態(tài)[4]。另外，人工實驗條件會引起生長環(huán)境的改變，使原本能通過常規(guī)方法正常分離培養(yǎng)的環(huán)境微生物因無法適應(yīng)而進(jìn)入VBNC狀態(tài)。這些VBNC微生物大多處于休眠狀態(tài)，僅維持著最低代謝活性。然而，目前在實驗室通過常規(guī)手段根本無法使其復(fù)蘇并分離培養(yǎng)[4]。
1.2微生物的豐度和競爭能力低
在自然界復(fù)雜的微生物群落中，存在許多豐度低但代謝功能強的微生物[5]。鑒于目前研究人員仍無法確定這些低豐度微生物中相對豐度最高的微生物所生長的自然環(huán)境，導(dǎo)致無法進(jìn)行有效富集；另外，即使某些微生物豐度相對較高，但如果培養(yǎng)基中底物豐富或以發(fā)酵底物作為碳源，在分離培養(yǎng)時，生長更快的微生物有可能迅速戰(zhàn)勝生長緩慢的目標(biāo)微生物，所以競爭力低仍可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[5]。
1.3無法模擬微生物生長的真實自然環(huán)境
由于對目的微生物所棲息的自然環(huán)境缺乏深入理解，例如，對微生物生長代謝過程中起關(guān)鍵作用的營養(yǎng)因子、不同生理階段對基質(zhì)濃度的需求、生長所需環(huán)境條件的變化規(guī)律等知識嚴(yán)重認(rèn)識不足，導(dǎo)致在實驗室條件下無法提供目的微生物生長所需的真實營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件。某種關(guān)鍵營養(yǎng)因子或生長條件不能滿足往往會導(dǎo)致微生物的培養(yǎng)失敗[6]。
1.4生長速率較低，檢測手段不夠靈敏
一些寡營養(yǎng)或生長緩慢的微生物細(xì)胞組成的超微型菌落，如果培養(yǎng)時間不夠或者檢測技術(shù)靈敏性不高，那么這些微生物的生長就不易被發(fā)覺，往往被忽略，表現(xiàn)為“未培養(yǎng)”[7]。
1.5培養(yǎng)基富營養(yǎng)化
由于自然界中數(shù)量龐大的環(huán)境微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)比較匱乏，多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài)[8]。高濃度營養(yǎng)物質(zhì)比較適合生長快且對其有抵抗能力的微生物，但可能會抑制那些生長速度較慢的微生物[9]，寡營養(yǎng)培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)生長緩慢的細(xì)菌[10]。當(dāng)微生物處于寡營養(yǎng)水生環(huán)境時，如果轉(zhuǎn)移到富營養(yǎng)培養(yǎng)基中，會因不適應(yīng)而突然死亡[10]。
1.6破壞或者忽視了環(huán)境中微生物之間的相互作用
自然界中的所有微生物并不是孤立存在，而是相互聯(lián)系和影響的。許多微生物之間可進(jìn)行物質(zhì)交換和信號交流，它們聯(lián)系緊密甚至高度依存。然而在實驗室采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離篩選目的微生物時會人為破壞這種依存關(guān)系，導(dǎo)致分離培養(yǎng)的失敗[11]；另外，當(dāng)前對環(huán)境微生物之間的這種高度復(fù)雜的互作機制研究并不多，認(rèn)識不夠深入、全面，導(dǎo)致不能指導(dǎo)難培養(yǎng)微生物的分離。
1.7病毒感染導(dǎo)致的培養(yǎng)效率降低
某些海洋環(huán)境樣品中，7%的菌群攜帶病毒，表層海水死亡細(xì)菌中大概10%-50%是由病毒感染引起的[12]。
2環(huán)境中未培養(yǎng)微生物培養(yǎng)方法的開發(fā)與應(yīng)用2.1常規(guī)培養(yǎng)方法的改進(jìn)
環(huán)境微生物的生長除了需要適宜的生長條件和常規(guī)的碳源、氮源等營養(yǎng)物外，可能更需要信號分子、關(guān)鍵酶或蛋白及電子供體/受體等某些關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，這些關(guān)鍵物質(zhì)或有利于關(guān)鍵生化反應(yīng)生物酶的合成而維持微生物必需的生命代謝活動，或可促進(jìn)處于VBNC狀態(tài)的微生物復(fù)蘇以恢復(fù)其活性。
2.1.1培養(yǎng)基的優(yōu)化與調(diào)整
(1)添加抑制劑、樣品抽提液或菌液
添加某種抑制劑(如抗生素)以抑制非目的菌的生長。本課題組以醬香型大曲為研究對象，對培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，添加抑制劑結(jié)合熱處理，分離出一株耐熱性良好的放線菌FBKL4.010[13]。樣品浸提液含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，向培養(yǎng)基添加浸提液是傳統(tǒng)培養(yǎng)的重要手段。Nguyen等利用土壤提取液(80%甲醇浸提)制備的強化培養(yǎng)基對根際土壤進(jìn)行分離，成功培養(yǎng)了許多以前未培養(yǎng)的細(xì)菌菌株，化學(xué)分析結(jié)果表明，土壤浸提液中含有低分子量有機物組分供微生物生長[14]。另外，Xian等利用Tepidimonas SYSU G00190W上清液的改良培養(yǎng)基，用于西藏和云南溫泉樣品中Chloroflexi的定向分離，從這些培養(yǎng)基中分離出的大多數(shù)菌落為未培養(yǎng)的Chloroflexi，其中36個為潛在新物種；代謝組學(xué)研究表明，培養(yǎng)上清液含有多種低分子量的有機基質(zhì)，可作為這些細(xì)菌生長的潛在營養(yǎng)物質(zhì)[15]。
(2)添加信號分子、電子供受體等物質(zhì)
在自然環(huán)境復(fù)雜的微生物群落中，微生物之間緊密聯(lián)系、相互作用，它們之間通過信號分子進(jìn)行信息交流。研究表明，信號分子環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)和?；呓z氨酸內(nèi)酯(Acyl-Homoserine Lactones，AHL)可顯著提高海洋細(xì)菌的培養(yǎng)效率[16]。Bruns等向培養(yǎng)基中加入AHL、cAMP等信號分子對富營養(yǎng)化湖泊天然浮游細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這種方法能促使細(xì)菌得到培養(yǎng)。其中，cAMP是最有效的信號分子，10μmol/L cAMP可使約占總數(shù)10%的微生物細(xì)胞培養(yǎng)出來，但培養(yǎng)出來的細(xì)菌如果不繼續(xù)添加信號分子，則又停止生長[17]。高絲氨酸內(nèi)酯(Homoserine Lactones，HSL)作為群體感應(yīng)信號分子可改善微生物的培養(yǎng)狀況[18]。Guan等向含低濃度鐵的培養(yǎng)基中加入外源的鐵載體和C8-HSL，發(fā)現(xiàn)原本在低濃度鐵培養(yǎng)基上不能生長的海洋細(xì)菌也能形成菌落[19]。此外，根據(jù)微生物的特性，添加生長所需的電子供受體也可提高微生物可培養(yǎng)率[11]。Sorokin等以甲酸鹽或氫作為電子供體，以單質(zhì)硫、硫代硫酸鹽或二甲基亞砜作為電子受體，對高鹽環(huán)境的沉積物樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終分離到Halodesulfurarchaeum新屬的8株菌[20]。
(3)添加維生素、生物酶或蛋白因子
Harbison等通過向培養(yǎng)基中添加維生素，從酸性沼澤中分離出一種專性厭氧、嗜酸的α-變形菌門(Alphaproteobacterium)新菌株，命名為CS4T[21]。另外，有研究者通過添加生物酶來提高微生物可培養(yǎng)率。Kim等通過向培養(yǎng)基中添加H2O2酶，成功分離培養(yǎng)了2株淡水放線菌acI譜系的新菌株，即Prochlorococcus和Pelagibacter[22]；同時，添加超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和H2O2酶等可降低培養(yǎng)過程中優(yōu)勢菌種代謝所產(chǎn)生的自由基、過氧化物和一些拮抗物質(zhì)的毒害作用，使微生物的培養(yǎng)效率提高[23]。對于VBNC微生物，添加藤黃微球菌分泌的復(fù)蘇促進(jìn)因子(Resuscitation-Promoting Factor，Rpf)有助于促進(jìn)其復(fù)蘇和生長[24]。余曉云利用藤黃微球菌Rpf從新疆土壤極端環(huán)境中分離篩選VBNC狀態(tài)菌，共分離得到60株菌，其中VBNC菌48株，14株為潛在新種[25]。翟竟余也對制藥廢水樣品進(jìn)行VBNC菌的分離篩選，共獲得了23株VBNC菌，包括Pseudomonas屬內(nèi)的新種細(xì)菌Pseudomonas pharmacopolae sp.nov.[26]。
(4)其他凝固劑代替瓊脂或改進(jìn)瓊脂培養(yǎng)基制備方法
瓊脂作為常規(guī)培養(yǎng)基的凝固劑，對某些微生物具有一定程度的毒害作用，從而降低了可培養(yǎng)率；而使用結(jié)冷膠作為凝固劑不僅對微生物沒有毒害作用，還可能增強受瓊脂抑制微生物的生長，凝固效果比瓊脂更好[27]。2005年，Tamaki等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比瓊脂培養(yǎng)基上的多10倍，約60%為新種[28]。2009年，該團隊又比較了瓊脂和結(jié)冷膠對從淡水沉積物中微生物菌落形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，108株菌中有22株只能在結(jié)冷膠培養(yǎng)基上形成可見菌落，并表現(xiàn)出新種的潛質(zhì)，剩下的86株在瓊脂和結(jié)冷膠上都生長，但其中52株在結(jié)冷膠上生長得更快；此外，結(jié)冷膠還顯著地促進(jìn)了具有代表性的生長緩慢微生物Gemmatimonas aurantiaca的菌落形成[29]。
除了用結(jié)冷膠代替瓊脂之外，有研究者還通過改進(jìn)瓊脂培養(yǎng)基的制備方法來提高微生物的可培養(yǎng)性。2014年，Tanaka等使用Gemmatimonas aurantiaca T-27T和3種代表性的環(huán)境樣品(土壤、沉積物和水)作為接種物，綜合比較了PT培養(yǎng)基(將磷酸鹽和瓊脂同時滅菌)和PS培養(yǎng)基(將磷酸鹽和瓊脂分別滅菌)上的菌落數(shù)目情況，結(jié)果表明，PS培養(yǎng)基上的菌落數(shù)更多，對PT培養(yǎng)基進(jìn)行化學(xué)分析表明H2O2抑制了微生物生長[30]。2018年，Kato等也利用PT培養(yǎng)基和PS培養(yǎng)基同時分離篩選森林土壤或池塘底泥的微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PS培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯多于PT培養(yǎng)基，經(jīng)過7 d以上的培養(yǎng)分別從PS培養(yǎng)基和PT培養(yǎng)基中分離出了98株和74株菌落作為慢速生長菌，通過PS培養(yǎng)基篩選到了一株α-變形菌門的新菌株[31]。另外，其他研究者通過PS培養(yǎng)基分離篩選到難以培養(yǎng)的烷烴降解菌[32]和放線菌[33]。
對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化與調(diào)整的方法經(jīng)濟實用、針對性較強、操作較簡單，但對于一些需要其他菌株輔助才能生長的類群分離效果就較差。同時，由于人們對某些微生物的認(rèn)識不全面，因此難以根據(jù)微生物的特性來設(shè)計合適的培養(yǎng)基。
2.1.2培養(yǎng)條件的優(yōu)化
(1)延長培養(yǎng)時間
延長培養(yǎng)時間可大幅度提高未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)率，有利于生長緩慢的微生物生長，但應(yīng)注意控制培養(yǎng)時間，因為培養(yǎng)時間越長，對微生物培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求就越高[34]，而且培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分會隨時間推移發(fā)生改變，可能會對微生物的生長產(chǎn)生不利的影響。Choi等通過采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和延長培養(yǎng)時間從海洋沉積物中分離微生物，分離出2株新海洋細(xì)菌，即Mooreiaceae和Catalimonadaceae[35]。Sun等在處理高濃度有機廢水的中溫升流式厭氧污泥床反應(yīng)器中，采用富集培養(yǎng)基并延長培養(yǎng)時間對微生物進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d后，成功地從污泥中分離出一株新厭氧菌TC1T，將其命名為Flexilinea flocculi gen.nov.sp.nov.[36]。Pulschen等通過采用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基、延長培養(yǎng)時間及選擇生長緩慢的細(xì)菌，從南極土壤樣本中分離微生物，成功地分離出了一些稀有的微生物，如Lapillicoccus、Flavitalea、Quadrisphaera、Motilibacter和Polymorphobacter[37]。賀瑞含從南北極環(huán)境中采集不同類型的樣品，通過改進(jìn)培養(yǎng)溫度、延長培養(yǎng)時間，采用稀釋R2A培養(yǎng)基分離出細(xì)菌約1 220株，其中包括182個潛在新物種[38]。
(2)絕跡稀釋法
絕跡稀釋法(Dilution-to-Extinction)是通過將環(huán)境樣品中微生物群體總數(shù)稀釋至痕量后再進(jìn)行培養(yǎng)的方法[39]，該方法降低了優(yōu)勢微生物的占比，可提高寡營養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)率[40]。Stingl等采用改進(jìn)的絕跡稀釋法從俄勒岡海岸和百慕大海域中培養(yǎng)微生物，分離出17株SAR11新菌株，以及幾株以前未培養(yǎng)的細(xì)菌種類[41]。Colin等采用絕跡稀釋法將河口沉積物稀釋至痕量后，采用384微孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離硫還原菌，篩選到很多硫還原菌新種[39]。Jimenez-Infante等采用絕跡稀釋法將紅海表層水樣接種于改良的低營養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周，結(jié)果得到2株SAR11新菌株，分別命名為RS39和RS40[42]。Bartelme等采用絕跡稀釋法將從針葉林淺表層土壤中提取的微生物細(xì)胞稀釋后，分別接種于2種培養(yǎng)基(這2種培養(yǎng)基的氨基酸和有機碳濃度相差100倍)，于96孔板、16℃下進(jìn)行培養(yǎng)，共分離出133株菌，其中包括以前未培養(yǎng)的菌株，這些菌株與Nakamurella、Nocardioides、Mycobacterium、Jatrophihabitans、Patulibacter、Conexibacter、Rhizobiales sp.、Reyranella和Microtrichales sp.strain AZCC_0197的序列最大相似性小于97%[43]。Henson等采用絕跡稀釋法培養(yǎng)浮游細(xì)菌，成功分離了8個新屬和7個新種的菌株[40]。
絕跡稀釋法一般采用96孔或者384孔板進(jìn)行高通量并行操作，提高了分離效率，但操作較復(fù)雜，周期較長。同時，由于每個孔的頂部空間是完全隔離的，因此很難供應(yīng)氣態(tài)底物；此外，當(dāng)以小體積培養(yǎng)細(xì)胞時，由于孔內(nèi)液體蒸發(fā)會導(dǎo)致培養(yǎng)物變干，從而不利于微生物生長[5]。
2.2共培養(yǎng)
自然生境中微生物之間的相互作用對群體生存來說非常重要[44]。這些相互作用通常是通過環(huán)境改變來介導(dǎo)的，微生物通過占用資源和排泄代謝產(chǎn)物來改變環(huán)境，從而影響自身和其他微生物的生長[45]。大多數(shù)共生菌對體外培養(yǎng)有抗性[46]，對相鄰細(xì)菌產(chǎn)生的信號和化學(xué)因子的生長依賴性可能是阻礙細(xì)菌離體生長最重要的因素[6]。營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌的基因組較小，缺乏必要的遺傳物質(zhì)來編碼必需的營養(yǎng)素，通常需要與其他細(xì)菌建立緊密的共生關(guān)系才能生存[6]。
自然生境中許多細(xì)菌依靠共生關(guān)系維系生長，有研究者通過添加細(xì)菌進(jìn)行共培養(yǎng)來提高培養(yǎng)率，如：Nichols等通過添加輔助菌株分離出一種新的嗜冷桿菌屬[47]；海洋沉積物中的自養(yǎng)氨氧化古生菌在與硫氧化細(xì)菌共培養(yǎng)時被成功地富集和培養(yǎng)[48]；D’Onofrio等發(fā)現(xiàn)在海洋沉積物中廣泛存在鐵載體依賴的未培養(yǎng)細(xì)菌，來自鄰近物種的鐵載體可以誘導(dǎo)其生長[49]；共生異養(yǎng)菌(如交替單胞菌Alteromonas等)可通過清除H2O2促進(jìn)原綠球藻屬(Prochlorococcus)的生長[50]。此外，交互共生培養(yǎng)法(Cross-Feeding Cultivation)也可提高培養(yǎng)率，如Kaeberlein等研究發(fā)現(xiàn)雖然菌株MSC1和MSC2很容易在培養(yǎng)皿中維持生長，但只能在共培養(yǎng)中實現(xiàn)，同樣，MSC1可以在培養(yǎng)皿中與另外2株菌(MSC4和MSC5)中的任意一株進(jìn)行共培養(yǎng)[51]；Bhuiyan等報道了由菌株GF9(Sphingopyxis)產(chǎn)生的卟啉型生長因子A-F在皮摩爾到納摩爾濃度下，可誘導(dǎo)先前未培養(yǎng)的菌株ASN212(Leucobacter)顯著增殖，但卻對產(chǎn)生菌GF9自身產(chǎn)生了毒性，GF9菌株與ASN212菌株的共培養(yǎng)試驗表明，ASN212菌株有助于GF9菌株長期培養(yǎng)[52]；吳家法對共培養(yǎng)30 d后的微包埋微生物采用流式細(xì)胞儀分選，分選后分別用MR2A和共培養(yǎng)流出液進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果獲得了100株細(xì)菌，其中8株疑似新種[53]。
共培養(yǎng)作為一種新型培養(yǎng)法，考慮了真實自然環(huán)境下微生物互作對微生物生長的影響，對于互生或共生關(guān)系的微生物針對性較強。但由于當(dāng)前對微生物間的互作機制及其對生長特性的影響研究有限，所以成功篩選出的難培養(yǎng)微生物種類并不多，需要進(jìn)一步加大微生物互作與生長之間關(guān)系的研究。
2.3原位培養(yǎng)
原位培養(yǎng)是將稀釋的環(huán)境樣品置于區(qū)室獨立小孔中，用半透性膜(0.03μm/0.2μm)上下封閉小孔，最終將其放回原來所棲息的自然環(huán)境或模擬生境中進(jìn)行培養(yǎng)。裝置的孔之間互不干擾，由于半透膜的選擇性，孔內(nèi)外的微生物細(xì)胞無法進(jìn)出半透膜，但自然環(huán)境中的某些信號分子或關(guān)鍵營養(yǎng)因子等小分子能穿透半透膜進(jìn)入孔中，為微生物所利用，進(jìn)而促進(jìn)孔中難培養(yǎng)微生物的生長。原位培養(yǎng)法主要包括擴散室法、分離芯片法、Trap技術(shù)、I-tip技術(shù)和膠囊包埋技術(shù)。這些方法都是通過模擬目標(biāo)微生物的自然環(huán)境進(jìn)行分離培養(yǎng)，有利于微生物與微生物或與自然環(huán)境之間建立化學(xué)交流。有關(guān)原位培養(yǎng)方法的開發(fā)與應(yīng)用如表1所示。
表1原位培養(yǎng)的應(yīng)用
2.3.1擴散室
2002年，Kaeberlein團隊設(shè)計了一種名叫“擴散室”(Diffusion Chamber)的裝置(圖1)，可用于培養(yǎng)海洋潮汐帶沉積物中的微生物，裝置由金屬環(huán)(墊圈)和緊貼兩側(cè)的半透性薄膜(孔徑為0.03μm)構(gòu)成[51]。將樣品瓊脂混合物注入裝置密封后進(jìn)行原位培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)會通過下層薄膜擴散到中間墊圈滿足微生物生長，裝置中的微生物也可與自然環(huán)境建立化學(xué)交流；但因薄膜孔徑很小，所以裝置內(nèi)外的微生物不能相互擴散[51]。利用擴散室能提供環(huán)境微生物生長所需的營養(yǎng)，而不必弄清其確切成分，方便便捷；但仍存在一定的局限性，比如通過擴散室培養(yǎng)的環(huán)境細(xì)胞形成的菌落一般很小，肉眼不可見[63]，較難檢測和分離，也就很難進(jìn)行高通量培養(yǎng)分離[73]；樣品的稀釋水平會影響擴散室培養(yǎng)微生物的效果；對平板制作和膜材料選擇要求也較高，不能破壞微生物生長[11]。
圖1擴散室裝置[51]Figure 1 Diffusion chamber for in situ microbial cultivation[51]
在此基礎(chǔ)上，不同類型膜基系統(tǒng)已被開發(fā)并應(yīng)用到自然環(huán)境樣品的分離培養(yǎng)中，很多緩慢生長的菌落也可被成功培養(yǎng)[44]。
2.3.2分離芯片
在開發(fā)應(yīng)用擴散室法培養(yǎng)微生物的基礎(chǔ)上，Nichols等開發(fā)了一種名叫“分離芯片”(Isolation Chip，ichip)的高通量分離裝置(圖2)，可用于大量分離培養(yǎng)環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物[62]。使用時，將有上百個通孔的分離板放在已稀釋的含樣品微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸液中(圖2A)，使每個通孔捕捉到含有適量微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基(圖2B)，最后將分離板夾在聚碳酸酯膜(孔徑為0.03μm)與上下兩層板構(gòu)成的半透性屏障中間(圖2C)，將裝置置于目標(biāo)微生物所棲息的環(huán)境中進(jìn)行原位培養(yǎng)[62,74]。
圖2分離芯片[62]Figure 2 Isolation chip(ichip)[62]
通過實驗證明，這種方法分離得到的微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了傳統(tǒng)分離方法，而且更有可能分離到新物種[73,75]。其原因可能是ichip中的細(xì)胞與外界環(huán)境的距離較近，信息交流更方便，會促進(jìn)細(xì)胞生長；采用ichip法可進(jìn)行高通量的分離培養(yǎng)；用顯微鏡觀察每個小孔中生長的微生物，避免了菌落觀察不到而被忽略的問題[11]。
2017年，Berdy等分別比較了ichip法和平板法分離培養(yǎng)海洋底泥和土壤中的微生物，發(fā)現(xiàn)無論是菌落數(shù)、菌落形態(tài)以及新種數(shù)目，ichip法均遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)平板法；作者也總結(jié)了ichip法的不足：(1)某些微生物的生長不僅依賴于在自然界中特定生長因子和/或鄰近物種的代謝產(chǎn)物，而且還需要共生微生物的物理接觸；(2)該方法不能用于培養(yǎng)干旱環(huán)境的微生物；(3)將ichip放置在水生沉積物表面，但沉積物表面常常出現(xiàn)含氧層，會導(dǎo)致ichip下形成缺氧環(huán)境，使ichip孔內(nèi)的細(xì)胞接觸的是非自然的環(huán)境[76]。以上這些限制都會影響樣品微生物的分離培養(yǎng)。
2.3.3 Trap技術(shù)
鑒于擴散室不能對放線菌進(jìn)行選擇性的分離，Gavrish等報道了一種用于分離絲狀放線菌的Trap裝置(圖3)，該裝置的結(jié)構(gòu)與“擴散室”相似，只是底部的半透膜孔徑為0.2-0.6μm，孔徑加大是為了能讓菌絲體穿過半透膜進(jìn)入生長盒，使用時將Trap裝置(墊圈內(nèi)最初為無菌固體培養(yǎng)基)置于盛有潮濕土壤樣品的培養(yǎng)皿中，裝置底部與土壤接觸良好，絲狀微生物選擇性地滲入裝置并形成菌落，黑暗條件下培養(yǎng)14-21 d[65]。
圖3 Trap裝置及示意圖[65]Figure 3 Image and diagram of the trap[65]注：1：底膜(孔徑0.2-0.6μm)；2：頂膜(孔徑0.03μm)；3：無菌瓊脂或結(jié)冷膠培養(yǎng)基；4：塑料或金屬墊圈Note:1:Bottom membrane filter(0.2-0.6μm pore size)；2:Top membrane filter(0.03μm pore size)；3:Agar or gellan gum；4:Plastic or metal washer
2012年，Jung等開發(fā)了一種新Trap式的濾板微捕集器(Filter Plate Micro Trap，F(xiàn)PMT)；FPMT是一種從自然環(huán)境中分離細(xì)菌的原位培養(yǎng)裝置，以過濾微孔板為主體(圖4A)，長12.4 cm、寬8.1 cm、高3 cm，由96個獨立的圓柱形空間作為培養(yǎng)微生物的腔室(圖4B)；培養(yǎng)時將裝置放在土壤樣品上，以誘集微生物進(jìn)入腔室，微生物生長所需的某些營養(yǎng)物質(zhì)也可擴散到培養(yǎng)基中[66]。
圖4 UNIFILTER過濾微孔板照片(A)和FPMT一孔示意圖(B)[66]Figure 4 Photograph of the UNIFILTER filtration microplate(A)and schematic diagram of one well of FPMT(B)[66]注：1：蓋子；2：培養(yǎng)基；3：PVDF濾膜(孔徑0.45μm)；4：土壤或者底泥樣品；5：微生物Note:1:Cover；2:Medium；3:0.45μm pore size PVDF filter；4:Soil or silt sample；5:Microorganisms
2.3.4 Isolation-Tip技術(shù)
2014年，Jung等開發(fā)了一種名叫“Isolation-Tip(I-tip)”的裝置(圖5)，可用于分離海綿共附生微生物。使用時，將裝置插入海綿的不同組織處(深度為0.5 cm)進(jìn)行培養(yǎng)，4周后將裝置中富集的細(xì)菌用平板法再進(jìn)行分離培養(yǎng)[68]。I-tip法也存在一定的局限性，比如若要將裝置應(yīng)用在流動的海水中就需進(jìn)行固定[77]。
圖5 I-tip裝置示意圖[68]Figure 5 Schematic diagram of the I-tip[68]注：1：黃色Tip(20-200μL)；2：微生物在I-tip中培養(yǎng)；3：50-100、150-212μm玻璃微珠；4：防水膠布；5：0.7%瓊脂培養(yǎng)；6：微生物由此進(jìn)入I-tip Note:1:Yellow tip(20-200μL)；2:Microbes are cultivated in I-tips；3:50-100,150-212μm glass beads；4:Waterproof adhesive；5:Medium with 0.7%agar；6:Microbes can penetrate between beads
2.3.5膠囊包埋技術(shù)
膠囊包埋技術(shù)又稱為單細(xì)胞封裝培養(yǎng)法、凝膠微滴培養(yǎng)法(Gel MicroDroplets，GMDs)。Zengler等設(shè)計了一個方法，將稀釋后的環(huán)境樣品與瓊脂糖混合，乳化成微滴(即微滴包埋膠囊)，然后將其裝入層析柱內(nèi)(層析柱用濾膜封口)，包埋膠囊在低營養(yǎng)的流動培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，再結(jié)合流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，將包含有單菌落的膠囊分選到含有培養(yǎng)基的96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，最終獲得純培養(yǎng)物[69]。這是一個開放連續(xù)補充營養(yǎng)的微系統(tǒng)，微生物間的代謝產(chǎn)物及信號分子可在膠囊間進(jìn)行擴散而被其他菌利用[44]，較好地模擬了微生物的自然生長條件。該方法能高通量地分離培養(yǎng)微生物，而且更易進(jìn)行下游的擴大培養(yǎng)，提高了微生物的培養(yǎng)率；但該方法成本較高、操作較復(fù)雜，而且存在一些技術(shù)問題，如包埋基質(zhì)機械強度低、透性差、微生物熱敏感等，因此還需要不斷改進(jìn)[78]。
原位培養(yǎng)技術(shù)通過模擬目標(biāo)微生物的自然環(huán)境來分離培養(yǎng)微生物，有利于微生物與微生物或微生物與自然環(huán)境之間建立化學(xué)交流，可在一定程度上提高環(huán)境微生物的成活率以及未培養(yǎng)或稀有類群的培養(yǎng)率[79]，但其成本較高、下游的分離純化鑒定工作量很大、周期較長、操作較復(fù)雜、可控性差，即將人為模擬自然環(huán)境條件下培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)移到實驗室條件馴化時，若選用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不適宜某些微生物的生長，就會使分離效率降低。
2.4微流控培養(yǎng)技術(shù)
微流控培養(yǎng)技術(shù)(Microfluidics Cultivation)是在微觀尺寸下對復(fù)雜流體進(jìn)行控制、操作和檢測的技術(shù)，其能短時間同時檢測多種未培養(yǎng)微生物的存在，還能獲得目標(biāo)微生物的純培養(yǎng)物[80]。微流控培養(yǎng)和分析設(shè)備是在單細(xì)胞水平上研究微生物相互作用的通用工具，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，該技術(shù)制造工藝和技術(shù)設(shè)備復(fù)雜、專業(yè)性強[81]。
2014年，Najah等采用一種超高通量的液滴微流控技術(shù)，在不到20 min的時間內(nèi)篩選超過100 000個細(xì)胞；通過將單個細(xì)菌在20μL液滴(含熒光纖維二糖水解酶底物的培養(yǎng)基)中隔室分離，直接從麥茬地篩選未培養(yǎng)細(xì)菌；根據(jù)纖維二糖水解酶活性對液滴進(jìn)行分選后，細(xì)菌種群的纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶活性分別提高了17倍和7倍，并且與選擇在含有淀粉和羧甲基纖維素作為碳源的培養(yǎng)基上生長時相比，分類學(xué)上的差異非常大[82]。2016年，Jiang等建立了一種微流控劃線平板法(Microfluidic Streak Plate，MSP)，從多環(huán)芳烴富集的土壤中分離到了許多未培養(yǎng)微生物，包括一株能降解熒蒽(Fluoranthene)的芽生球菌(Blastococcus)新種[83]。2019年，趙瑩彤等設(shè)計并制備了一種微流控芯片，其單個元件是由上部帶有凹槽的“U”型結(jié)構(gòu)組成，該芯片能捕獲真菌單細(xì)胞，對單細(xì)胞可正常培養(yǎng)48 h以上，并且能觀察到酵母出芽、孢子萌發(fā)等過程，可用于真菌單細(xì)胞的捕獲、培養(yǎng)、定位和實時觀察，具有簡單、方便、直觀的特點[84]。
2.5基于細(xì)胞分選的培養(yǎng)技術(shù)
細(xì)胞分選技術(shù)通常用來從復(fù)雜的微生物群落中分離單個細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。目前細(xì)胞分選技術(shù)包括光學(xué)鑷子和熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)等，常與微液滴或微流控技術(shù)相結(jié)合。Irie等報道了一種利用細(xì)胞分選系統(tǒng)對活性污泥微生物群落中未培養(yǎng)的嗜酸菌和硝化螺菌進(jìn)行物理富集的新方法[85]。Abe等報道了一種基于散射特征的高通量分離技術(shù)，將氨氧化細(xì)菌菌落直接從活性污泥中分離出來，避免了長時間培養(yǎng)和富集偏差，接種到含培養(yǎng)基的96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，成功地分離出了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)中的新菌株[86]。Fujitani等利用前向散射(Forward Scatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向散射(Side Scattering，SSC)結(jié)合的方式從富集樣品中分離得到了3株硝化螺菌屬中未培養(yǎng)的菌種[87]，并報道了一種針對硝化細(xì)菌微菌落形成的分離方法[88]。與傳統(tǒng)的細(xì)胞分選機制不同，此技術(shù)既能保證培養(yǎng)條件，又規(guī)避了種間競爭的影響，但該方法建立的時間較短、技術(shù)還不夠成熟，還需繼續(xù)探索[80]。
3總結(jié)與展望
隨著以原位培養(yǎng)、微流控培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞分選技術(shù)等為代表的新型培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步成熟以及高通量測序的迅猛發(fā)展，越來越多的微生物被發(fā)現(xiàn)，特別是一些難培養(yǎng)微生物或微生物新種被成功地分離培養(yǎng)，但截至目前絕大部分微生物還是無法培養(yǎng)出來。究其原因，制約大部分微生物無法培養(yǎng)的原因有2個方面：(1)設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜及技術(shù)要求高等因素導(dǎo)致原位培養(yǎng)、微流控培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞分選技術(shù)等新型培養(yǎng)方法還無法廣泛應(yīng)用；(2)對環(huán)境微生物生長所必需的關(guān)鍵營養(yǎng)因子或信號分子的種類、VBNC微生物的復(fù)蘇過程及機制、微生物互作機制、代謝途徑及調(diào)控機制等的認(rèn)識十分匱乏。
針對目前的研究狀況，我們認(rèn)為可從以下研究方向著手：(1)針對成功分離到的難培養(yǎng)微生物，從生理特點、代謝途徑及營養(yǎng)需求等方面探索微生物可培養(yǎng)機理，破解其可培養(yǎng)的密碼，為后續(xù)其他難培養(yǎng)微生物奠定理論基礎(chǔ)；(2)傳統(tǒng)培養(yǎng)法+新型培養(yǎng)法、培養(yǎng)法+多組學(xué)技術(shù)等方法的結(jié)合，取長補短。比如，將原位培養(yǎng)與共培養(yǎng)或者膜技術(shù)結(jié)合，既可以模擬自然生長環(huán)境，又考慮了微生物與微生物之間的相互作用。目前，培養(yǎng)組學(xué)[89]主要應(yīng)用于培養(yǎng)和鑒定人類腸道微生物，未來可將該技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)；其次，多組學(xué)技術(shù)能夠深入挖掘功能基因及微生物、揭示重要代謝途徑，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白(酶)或代謝物，從分子層面探究微生物代謝途徑和生理生化機制，以期尋找對難培養(yǎng)微生物生長起關(guān)鍵作用的營養(yǎng)物質(zhì)以及培養(yǎng)條件。(3)研究群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)與復(fù)蘇促進(jìn)因子之間的關(guān)系，從微生物互作的角度揭示VBNC復(fù)蘇機制。
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