研究簡介
基因組在細(xì)胞中的空間組織及其三維結(jié)構(gòu)如何驅(qū)動細(xì)胞功能一直是生物學(xué)中的重大挑戰(zhàn)。在細(xì)菌中，基因組DNA被壓縮成一個高度有序、密集的狀態(tài)，稱為核樣體（nucleoid）。盡管近年來在細(xì)菌三維基因組結(jié)構(gòu)的研究上取得了一定進(jìn)展，但由于Hi-C等方法的分辨率較低，核樣體的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能組織仍然不明確。在細(xì)菌中，基因組DNA被壓縮成高度有序的濃縮狀態(tài)，稱為類核3,4,5。盡管近幾十年來在表征細(xì)菌3D基因組結(jié)構(gòu)方面取得了進(jìn)展，但由于Hi-C 9,10,11等方法的低分辨率接觸圖，類核的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能組織仍然難以捉摸。在這里，研究人員開發(fā)了一種增強(qiáng)的Micro-C染色體構(gòu)象捕獲，實(shí)現(xiàn)了10堿基對（bp）分辨率。這種超高分辨率分析揭示了大腸桿菌類核中的元素空間結(jié)構(gòu)，包括染色體發(fā)夾（CHIN）和染色體發(fā)夾結(jié)構(gòu)域（CHID）。這些結(jié)構(gòu)由組蛋白樣蛋白H-NS和StpA組織，在抑制水平轉(zhuǎn)移基因方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。H-NS的破壞會導(dǎo)致3D基因組的劇烈重組，減少CIN和CHID，而去除H-NS和StpA會導(dǎo)致它們完全分解、水平轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄增加和生長延遲。在netropsin上觀察到類似的效果，它與H-NS和StpA競爭富含AT的DNA結(jié)合。CHIN之間的相互作用進(jìn)一步將基因組組織成孤立的環(huán)，從而可能絕緣活性縱子。Micro-C分析表明，所有活躍轉(zhuǎn)錄的基因都以轉(zhuǎn)錄依賴性方式形成不同的縱子大小的染色體相互作用結(jié)構(gòu)域（OPCID）。這些結(jié)構(gòu)在Micro-C圖上顯示為方形圖案，反映了整個轉(zhuǎn)錄區(qū)域的連續(xù)接觸。這項(xiàng)工作揭示了大腸桿菌類核的基本結(jié)構(gòu)元素，強(qiáng)調(diào)了它們與類核相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄機(jī)制的聯(lián)系。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
將大腸桿菌菌株的單個菌落在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至固定期，然后用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋至OD600約為0.08。培養(yǎng)物在37°C下生長，直到OD600達(dá)到約0.4。將每種培養(yǎng)物的150μl等分試樣進(jìn)一步稀釋至約0.01的OD600，轉(zhuǎn)移到蜂窩孔中，并使用Bioscreen C自動生長曲線分析儀在37°C下劇烈搖動孵育。每10分鐘自動記錄一次OD600值，并根據(jù)收集的數(shù)據(jù)繪制生長曲線。Bioscreen C自動生長分析儀在本研究中用于量化突變體（如Δhns/ΔstpA）和藥物處理（如Rif、bleomycin）后的細(xì)菌生長表型。通過連續(xù)監(jiān)測OD?????，對比野生型與突變體（如ΔmukBEF溫度敏感株）的生長速率差異，為CHINs/CHIDs的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提供生理學(xué)證據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
開發(fā)一種增強(qiáng)型Micro-C染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)，以10個堿基對的超高分辨率分析了大腸桿菌（Escherichia coli）基因組的三維（3D）結(jié)構(gòu)，揭示了其基因組在活性和沉默狀態(tài)下的基本組織形式。通過這種技術(shù)，分析了大腸桿菌基因組的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了幾種基本的空間結(jié)構(gòu)，包括染色體發(fā)夾（CHINs）和染色體發(fā)夾域（CHIDs）。這些結(jié)構(gòu)由類組蛋白H-NS和StpA組織，對抑制水平轉(zhuǎn)移基因（HTGs）的表達(dá)起關(guān)鍵作用。破壞H-NS會導(dǎo)致三維基因組的顯著重組，減少CHINs和CHIDs，而同時去除H-NS和StpA則會導(dǎo)致它們完全解體，增加水平轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致生長延遲。H-NS缺失會導(dǎo)致3D基因組重組并減弱CHINs/CHIDs，而H-NS/StpA雙敲除則完全破壞這些結(jié)構(gòu)，伴隨HTGs的轉(zhuǎn)錄激活和生長延遲。此外，轉(zhuǎn)錄活躍的基因形成操作子大小的染色體互作域（OPCIDs），其結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄活性直接相關(guān)，表現(xiàn)為Micro-C圖譜中的方形接觸模式。
圖1、超高分辨率Micro-C圖譜揭示了大腸桿菌基因組的復(fù)雜3D組織。a）在Micro-C程序的不同步驟后對DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，展示了超高分辨率映射所需的片段化模式。b）Micro-C接觸圖示例，顯示OPCID、CHIN和CHID以及轉(zhuǎn)錄活性譜和縱子軌跡。c-e，Micro-C和Hi-C數(shù)據(jù)比較：正常生長條件下WT大腸桿菌細(xì)胞生成的Micro-C圖譜（c）;使用標(biāo)準(zhǔn)Hi-C協(xié)議在相同細(xì)胞上生成的Hi-C接觸圖（d）;大腸桿菌MG1655（e）的Hi-C圖譜。
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