2.2最小抑菌濃度
MIC是衡量抑菌物質(zhì)抑菌能力的重要指標(biāo)之一。不同濃度的P2和P3對腐生葡萄球菌的抑菌效果如圖2所示。當(dāng)P2和P3質(zhì)量濃度≥0.78 mg/mL時，同一濃度下與對照組相比，實驗組吸光值變化不大，說明腐生葡萄球菌生長受到抑制;當(dāng)P2和P3質(zhì)量濃度<0.78 mg/mL時，同一濃度下與對照組相比，實驗組吸光值增加，說明在該濃度范圍P2和P3不能抑制或不能完全抑制腐生葡萄球菌的生長。實驗結(jié)果表明P2、P3的最小抑菌濃度均為0.78 mg/mL。
A-P2實驗組;B-P3實驗組
圖2鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌的抑菌效果
2.3生長曲線
細(xì)菌生長曲線能夠反映菌株生長狀況。由圖3可知，對照組腐生葡萄球菌生長曲線呈“S”型趨勢，在0～2 h是生長潛伏期，2～12 h為指數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入生長平穩(wěn)期。P2和P3以0.25 MIC作用于腐生葡萄球菌時，細(xì)菌難以進(jìn)入指數(shù)生長期;在MIC的P2和P3作用下，腐生葡萄球菌生長可完全被抑制。生長曲線實驗結(jié)果表明，P2和P3對腐生葡萄球菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用。陳夢玲等研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油可延緩腐生葡萄球菌進(jìn)入指數(shù)生長期，與本實驗結(jié)果相似。
A-P2實驗組;B-P3實驗組
圖3鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌生長曲線影響
2.4電導(dǎo)率值
當(dāng)菌體細(xì)胞受到外界不良影響時，細(xì)胞膜滲透性會改變，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，此時可通過菌懸液電導(dǎo)率的變化判斷菌體的受損情況。由圖4可知，添加MIC和0.5 MIC的P2和P3實驗組與對照組的電導(dǎo)率變化趨勢相似，都呈現(xiàn)先快速上升后緩慢增長的趨勢;添加不同濃度P2和P3的實驗組2～4 h內(nèi)電導(dǎo)率顯著高于對照組(P<0.05)，說明P2和P3均可破壞腐生葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外泄;隨著時間的延長，對照組電導(dǎo)率與添加不同濃度P2和P3的實驗組電導(dǎo)率相近，推測是菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象所致。由此可推測，P2和P3可通過增強(qiáng)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性，抑制細(xì)菌正常生長代謝，從而造成菌體死亡。徐小烽等采用同樣的方法研究鰱魚重組Cystatin C對腐生葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理，結(jié)果表明鰱魚重組Cystatin C能夠破壞銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性，使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，結(jié)論與本實驗相似。
A-P2實驗組;B-P3實驗組
圖4鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌細(xì)胞外電導(dǎo)率影響
注:同一時間點下不同處理組之間字母不同代表差異顯著(P<0.05)(下同)。
2.5紫外吸收值
細(xì)菌培養(yǎng)液內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸含量是評價細(xì)菌細(xì)胞膜破環(huán)程度的重要指標(biāo)。由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組培養(yǎng)液在260 nm和280 nm處吸光值變化不大，說明對照組培養(yǎng)液中核酸和蛋白質(zhì)含量相對穩(wěn)定;添加MIC和0.5 MIC的P2和P3實驗組在260 nm和280 nm處吸光值整體上升，且吸光值在2～8 h內(nèi)均顯著高于對照組(P<0.05)，說明P2和P3均可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)流出;P3在260 nm和280 nm處的吸光值始終高于P2，說明P3對腐生葡萄球菌細(xì)胞膜破環(huán)程度大于P2，與前文抑菌圈實驗結(jié)果相符合。由此可以推斷，P2和P3可破壞腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)菌生長繁殖，YE等研究曲酸對腐生葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞性，也得到相似的結(jié)論。
A-P2實驗組(OD260nm);B-P3實驗組(OD260nm);C-P2實驗組(OD280nm);D-P3實驗組(OD280nm)
圖5鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性影響
2.6 SOD和CAT活力
SOD和CAT對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)起著重要的防御作用。由表2可以看出，0～8 h內(nèi)加入MIC和0.5 MIC的P2和P3后SOD活力顯著高于對照組(P<0.05)，說明P2和P3能夠大幅度提高腐生葡萄球菌胞內(nèi)SOD活力，從而影響菌體正常生長代謝;添加MIC的P2和P3比添加0.5 MIC的P2和P3的SOD活力提升得更高，說明P2和P3對腐生葡萄球菌SOD活力影響具有濃度依賴性;2～8 h添加MIC的P2處理組CAT活力顯著低于對照組(P<0.05)，添加MIC的P3在2～6 h內(nèi)CAT活力也低于對照組。由此可推測，P2和P3可通過提升腐生葡萄球菌SOD活力和降低CAT活力來影響菌體正常生長。黃偉英等采用試劑盒方法測定乳酸鏈球菌素對腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果表面乳酸鏈球菌素可通過降低腐生葡萄球菌SOD和CAT活力使菌體抗氧化動態(tài)失衡，導(dǎo)致菌體生長受到抑制。
表2多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌SOD和CAT活力影響單位:U/mL
注：同一列的不同字母代表差異顯著(P<0.05)。
2.7生物掃描電鏡
SEM可從細(xì)菌的菌體形態(tài)上直觀反映鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌菌體結(jié)構(gòu)的影響。由圖6可知，添加酶解液的對照組菌體大小均勻，呈現(xiàn)飽滿的圓球狀，表面光滑平整，說明菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，生長良好。MIC和0.5 MIC的P1和P2處理組菌體形狀不規(guī)則、表面粗糙褶皺、無充盈感、扭曲變形、部分菌體細(xì)胞出現(xiàn)破損、內(nèi)容物外泄、相互黏附現(xiàn)象，且MIC P3處理組菌體胞膜大量剝落、破裂畸形，細(xì)胞損傷最嚴(yán)重。由此可推測，P2和P3可通過破壞腐生葡萄球菌的菌體結(jié)構(gòu)抑制細(xì)菌生長繁殖。ZHANG等采用SEM觀察經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后的腐生葡萄球菌，菌體表面出現(xiàn)干癟，凹陷，相互黏附，破碎，研究結(jié)果與本實驗相似。
A-酶解液處理組;B-MIC P2處理組;C-0.5MIC P2處理組;D-MIC P3處理組;E-0.5MIC P3處理組
圖6酶解液和鱖魚多肽-鋅螯合物處理后腐生葡萄球菌掃描電鏡圖
3結(jié)論
本研究以鱖魚肉為原料，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解制得水解物，之后與ZnSO4·7H2O螯合，再經(jīng)“離心-醇沉法”和“醇沉-離心法”制備出鱖魚多肽-鋅螯合物P1、P2和P3。探究P1、P2和P3的抑菌活性，抑菌圈實驗結(jié)果顯示P2和P3對腐生葡萄球菌的抑菌效果更佳;P2和P3對腐生葡萄球菌的MIC均為0.78 mg/mL。腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)制的解析為:P2和P3能夠增加細(xì)胞膜通透性、破壞細(xì)胞膜完整性、改變細(xì)菌結(jié)構(gòu)、提升細(xì)菌胞內(nèi)SOD活力和降低CAT活力，從而達(dá)到抑菌作用。其中，抑菌圈、紫外吸收和生物掃描電鏡實驗結(jié)果顯示，P3的抑菌效果優(yōu)于P2，可能是P3=P1+P2的緣故，2種螯合物協(xié)同作用時能夠達(dá)到更好的抑菌效果。研究結(jié)果表明，鱖魚多肽-鋅螯合物可以作為抑制腐生葡萄球菌的備選劑之一，未來本團(tuán)隊將繼續(xù)研究鱖魚多肽-鋅螯合物促進(jìn)水產(chǎn)品保鮮的機(jī)理。
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